Sitoutumismääritys vs. toiminnallinen määritys: ero selitettynä

Sitoutumiskokeella selvitetään, tunnistaako molekyyli kohdeproteiininsa ja millä affiniteetilla se sitoutuu siihen. Toiminnallinen koe antaa vastauksen seuraavaan kysymykseen: johtaako tämä vuorovaikutus myös mitattavissa olevaan biologiseen vasteeseen? Juuri tässä piilee ratkaiseva ero kohdeproteiinin sitoutumisen ja vaikutuksen välillä.

Luotettavien tulosten saamiseksi näitä kahta menetelmää yhdistetään usein, etenkin prekliinisessä tutkimuksessa ja peptidi-kohde-vuorovaikutusten tutkimuksessa. Erityisesti näissä tapauksissa puhtaus, identiteetti ja erän yhdenmukaisuus voivat vaikuttaa mittaustuloksiin. Siksi tarjoamme tutkimus peptides illemme eräkohtaiset COA-sertifikaatit, jotta käytetyt materiaalit voidaan dokumentoida jäljitettävästi.

Miksi sitoutuminen ei ole sama asia kuin biologinen vaikutus

Sitoutumismäärityksissä mitataan molekyylin ja sen kohderakenteen, kuten reseptorin, entsyymin tai kuljettajaproteiinin, välistä fysikaalista vuorovaikutusta. Painopiste on affiniteetissa ja kinetiikassa: toisin sanoen siinä, kuinka voimakkaasti, kuinka nopeasti ja kuinka kauan sitoutuminen tapahtuu. Tässä esitellään aktivaation ja inhibitioin luokittelun perusteet: Agonistit ja antagonistit: erot.

Toiminnallisissa määrityksissä sen sijaan mitataan aiheutunutta, estettyä tai moduloitua biologista vastetta. Painopiste on tehoissa ja vaikuttavuudessa, eli siinä, kuinka paljon yhdistettä tarvitaan ja kuinka voimakas vaikutus on. Positiivinen sitoutumistulos osoittaa siis vain kohteen sitoutumisen, ei automaattisesti aktivaatiota, estymistä tai biologista merkitystä. Lyhyesti sanottuna: sitoutumismääritykset tuottavat vuorovaikutustietoja, kun taas toiminnalliset määritykset tuottavat vaikutustietoja, ja ne eroavat siten HPLC-analyysistä, jota käytetään peptides.

Suora vertailu päivittäisessä laboratoriotyössä

Laboratorion päivittäisessä työssä ero sitoutumismäärityksen ja toiminnallisen määrityksen välillä tulee selkeimmin esiin, kun vertaillaan suoraan tutkimuskysymystä, järjestelmää ja tulosten tulkintaa. Asiaan liittyvät tekniset termit löytyvät täältä: Tutkimussanasto: keskeiset termit lyhyesti selitettyinä.

Lisätietoja keskeisten pitoisuusparametrien tulkinnasta löytyy täältä: EC50 vs. IC50 – mitä nämä arvot tarkoittavat?

Tutkimuksessa käytettävät tyypilliset sitoutumismääritykset

Yleisiä tiedostomuotoja ovat muun muassa:

• Kilpailumääritykset osoittavat, syrjäyttääkö testimolekyyli vertailuligandin kohteesta. Ne soveltuvat syrjäytymisen, selektiivisyyden ja alustavan osumien priorisoinnin arviointiin.
• SPR- ja BLI-menetelmät seuraavat sitoutumista ja irtoamista reaaliajassa. Tämän avulla voidaan määrittää affiniteetti ja sitoutumiskineettiset parametrit reseptori–ligandi- tai peptidi–kohde-vuorovaikutuksissa.
• Fluoresenssipohjaisissa sitoutumistesteissä mitataan suoraa sitoutumista tai syrjäytymistä merkittyjen koettimien avulla. Ne ovat usein hyödyllisiä, kun tarvitaan keskisuurta tai suurta läpimenokapasiteettia.
• Muut suorat biofysikaaliset sitoutumismittaukset toimivat usein ortogonaalisena vahvistuksena, jonka avulla todelliset vuorovaikutukset voidaan erottaa määrityksen aiheuttamista artefakteista.

Tutkimuksessa käytettävät tyypilliset toiminnalliset määritykset

Yleisiä toiminnallisia mittaustuloksia ovat muun muassa:

• cAMP- ja kalsiummääritykset mittaavat signaalinvälityksen varhaisia vaiheita, erityisesti sellaisten reseptorien osalta, joiden kytkeytyminen solunsisäisiin signaalinvälitysketjuihin on määritelty.
• Reporterimääritykset heijastavat transkriptio- tai signaalireittivasteita prosessin loppupäässä ja voivat paljastaa aktivaatiota, inhibitioita tai osittaisia vaikutuksia.
• Entsyymiaktiivisuuden määrityksissä mitataan, lisääkö tai estääkö molekyyli katalyyttistä toimintaa ja kuinka voimakas tämä vaikutus on.
• Solujen lisääntymistä, elinkelpoisuutta tai sytokiinipitoisuuksia mittaavat määritykset osoittavat modulaation vaikutukset solutasolla, mutta ne riippuvat yleensä enemmän käytetystä mallista.

Se, kuinka paljon tietoa nämä tiedot antavat, riippuu suuresti solumallista, reseptorien ilmentymisestä ja valitusta signalointireitistä.

Milloin kukin määritysmenetelmä on sopiva

Sitoutumiskokeet ovat usein paras lähtökohta, kun on tarpeen seulota useita ehdokkaita, testata suoraan kohteen sitoutumista tai selvittää selektiivisyyteen liittyviä kysymyksiä. Ne ovat erityisen hyödyllisiä hit-yhdisteiden tunnistamisen alkuvaiheissa, koska niillä voidaan usein havaita vuorovaikutukset suhteellisen suoralla ja hallitulla tavalla.

Toiminnalliset määritykset saavat yhä suuremman merkityksen, kun on arvioitava tehoa, vaikutusmekanismia ja biologista merkitystä. Käytännössä yhdistetyt menetelmät ovat yleisiä: yhdiste voi olla toiminnallisesti neutraali huolimatta hyvästä affiniteetista, kun taas havaittu vaikutus voi johtua myös epäsuorasti tai kohteen ulkopuolelta. Vain näiden kahden määritystyypin yhdistelmä antaa yleensä luotettavan kuvan, mutta se ei korvaa LC-MS-peptidien tunnistustestiä.

Molempien lähestymistapojen vahvuudet ja rajoitukset

• Sitoutumismääritykset ovat luotettavia, kun halutaan mitata suoria vuorovaikutuksia tarkasti ja usein suhteellisen hallituissa järjestelmissä.
• Niiden rajoituksena on puutteellinen ymmärrys prosessin myöhemmistä biologisista vaiheista: pelkkä sitoutuminen ei sinänsä selitä biologista vaikutusta.
• Funktionaaliset määritykset vastaavat paremmin biologista järjestelmää ja voivat paljastaa aktivaatiota, inhibitioita, osittaisia vaikutuksia tai signalointireittien modulaatiota.
• Niiden rajoituksena on suurempi kontekstiriippuvuus: solumalli, reseptorien ilmentyminen, viljelyliuos, ajoitus ja mittaustulosten tulkintatapa voivat vaikuttaa tulokseen merkittävästi.
• Yleisiä väärinkäsityksiä ovat esimerkiksi affiniteetin ja tehokkuuden sekoittaminen toisiinsa tai yksittäisten tulosten yliarvioiminen ilman riippumatonta vahvistusta. Tärkeitä valintaperusteita ovat tutkimuskysymys, kohderyhmä, tutkimuksen läpimenokapasiteetti, käytettävissä oleva mallijärjestelmä sekä vaadittu näyttötaso.