Измерване на потенциала на митохондриалната мембрана: методи
Измерване на потенциала на митохондриалната мембрана
Ако искате да измерите потенциала на митохондриалната мембрана, обикновено в лабораторията ще определите ΔΨm косвено, като използвате потенциално-зависими флуоресцентни багрила или сензори. Кой метод е подходящ зависи главно от това дали работите с интактни клетки, изолирани митохондрии или по-контролирана система, както и от това какъв апарат е на разположение. Речникът за научни изследвания peptides помага за по-доброто разбиране на ключовите термини. Основни сведения за вътреклетъчното усвояване можете да намерите в раздела „Усвояване на пептиди в клетките“.
При експерименти с живи клетки типични методи са TMRE, TMRM и JC-1. Резултатите стават надеждни само при наличието на ясни референтни състояния, разумна нормализация и допълнителни показатели като жизнеспособност, митохондриална маса или биоенергетика.
Разглеждане на ΔΨm в контекста: какво всъщност се измерва
ΔΨm описва разликата в напрежението през вътрешната митохондриална мембрана, а не през клетъчната мембрана. Тя възниква в резултат на неравномерното разпределение на заряда и селективния транспорт на йони; в митохондриите тя е тясно свързана с транспорта на протони и дихателната верига. Поради това ΔΨm се използва като функционален маркер: промените в нея могат да сигнализират за стрес, развързване или нарушения в преобразуването на енергията на ранен етап и следователно са от значение за изследванията в областта на метаболитния стрес, например с MOTS‑c. За избора на тест обаче само общото определение на мембранния потенциал не е достатъчно, тъй като решаващо значение имат видът на пробата, поведението на оцветителя и логиката на анализа. Подходящи продукти, свързани с митохондриите, за изследвания на мембранния потенциал и оксидативния стрес можете да намерите в раздела MitoPrime.
Кратък преглед на методите: JC-1, TMRE/TMRM, родамин и сензори
| Метод | В коя система е полезно? | Подходящи инструменти | Анализ | Основни предимства и ограничения |
|---|---|---|---|---|
| JC-1 | Предимно неповредени клетки | Микроскопия, проточна цитометрия, апарат за отчитане на микроплаки | Ратиометрично чрез червено/зелено | Частично намалява разликите в натоварването; зависи от концентрацията, температурата и образуването на агрегати. |
| TMRE/TMRM | Неувредени живи клетки | Микроскопия, проточна цитометрия, апарат за отчитане на микроплаки | Предимно относителна интензивност | Това е много често срещано при експерименти с живи клетки; трябва да се контролират претоварването, самогасенето, фототоксичността и ефлуксът. |
| Барвители на базата на родамин | Неувредени клетки, а отчасти и изолирани митохондрии | Микроскопия, проточна цитометрия, флуорометър | Предимно относителна интензивност | Доказан и ясен метод, но често по-податлив на грешки при количествените измервания; ефектите на гасене и преразпределение могат да затруднят интерпретацията. |
| Изследвания върху изолирани митохондрии | Изолирани органели или строго определени системи | Флуориметър, скенер за микроплаки | Относително; в определени условия може частично да се калибрира | Добър контрол върху субстратите и инхибиторите; по-малко физиологичен, тъй като самото изолиране може да повлияе на състоянието. |
| Генетично кодирани сензори | Клетъчни модели, подходящи за генетично манипулиране | Предимно микроскопия | В зависимост от сензора – относително или ратиометрично | Възможно е субклетъчно насочване и проследяване във времето; артефактите при експресията и калибрирането обаче продължават да представляват ограничения. |
Планирайте надежден експеримент с ΔΨm
- Определете модела предварително: интактните клетки, изолираните митохондрии или тъканите изискват различни среди, субстрати, температури и времеви прозорци за измерване.
- Определете референтни състояния – най-малко състоянието на превозното средство и ясно деполяризирано състояние – така че промените в сигнала да могат да бъдат интерпретирани от биологична гледна точка.
- Оптимизирайте концентрацията на багрилото, времето за натоварване, етапите на промиване и настройките на апаратурата, така че сигналът да остане в линейния диапазон и да не възникне нито насищане, нито самогасене.
- Планирайте нормализирането на данните на ранен етап, например спрямо броя на клетките, количеството протеини или митохондриалната маса, и разграничавайте техническите от биологичните повторения.
Контроли и артефакти, които са от решаващо значение за теста
- Отделете истинските ефекти на ΔΨm от промените в митохондриалната маса, размера на клетките, целостта на мембраните или общата жизнеспособност; в противен случай разликата в яркостта бързо се тълкува погрешно.
- Типичните фактори, които могат да повлияят на резултатите, включват пренасищане с багрило, фотоизбледняване, ефлукс, промени в рН, влиянието на потенциала на плазмената мембрана и разлики между отделните партиди проби.
- Развързващите агенти и инхибиторите на дихателната верига са полезни функционални контроли, но те предизвикват различни биологични състояния и не трябва да се приравняват.
- Следователно паралелните измервания на жизнеспособността, митохондриалната маса и морфологията трябва да бъдат задължителна част от всеки тест за ΔΨm, дори и в защитните модели с Humanin.
Интерпретирайте данните за ΔΨm строго
По-силният сигнал не означава автоматично по-добра митохондриална функция. Дори хиперполяризацията може да е признак за стрес или дисрегулация. Ето защо ΔΨm трябва да се отчита като промяна спрямо подходящи контролни групи; интензитетите или съотношенията трябва да се тълкуват като абсолютни стойности в mV само в определени, добре калибрирани системи. Изводите относно механизмите стават надеждни само при наличието на допълнителни показатели като АТФ, OCR/ECAR, ROS, маркери за апоптоза или митохондриална маса. Особено при in vitro проучвания с изследователски подходи, свързани с митохондриите, например с SS‑31 (Еламипретид), MOTS‑c- или NAD+-свързани експериментални модели, ΔΨm е само един от няколкото крайни показателя. Специфичните за всяка партида сертификати за анализ (COA) на изследователските материали, като тези, които предоставяме на 24Peptides, също спомагат за възпроизводимостта на експериментите.
