Peptididentifikation ved hjælp af LC-MS: Sådan bekræfter LC-MS et peptid

En ren HPLC-top er i sig selv ikke bevis for, at et peptid rent faktisk er det forventede molekyle. Når det gælder peptidets identitet, er det ikke kun prøvens tilsyneladende renhed, der tæller, men også om den målte masse og, hvor det er relevant, fragmentmønsteret stemmer overens med målsekvensen. Det er netop her, at LC-MS er bedre end en ren HPLC-kontrol.

En LCMS-identitetstest for peptides kombinerer kromatografisk adskillelse med massespektrometri. Dette gør det muligt at kontrollere, om prøven stemmer overens med den forventede peptidmasse, om måleresultaterne ligger inden for rimelige tolerancer, og om et COA eller en testrapport rent faktisk er meningsfuld. Dette er af afgørende betydning, især for længere, modificerede eller analytisk mere udfordrende peptides.

Hvorfor renhed alene ikke er nok

Mange brugere ser først på HPLC-renheden. Det er forståeligt, da HPLC er et veletableret og meget nyttigt trin i kvalitetskontrollen. Det viser, hvordan komponenterne i en prøve adskilles kromatografisk, og hvilken andel der fremstår som hovedtoppen. Det er værdifuldt i forbindelse med vurderingen af urenheder. Til en entydig identitetsbestemmelse er det imidlertid ikke tilstrækkeligt.

Årsagen er enkel: HPLC adskiller stoffer ud fra deres kromatografiske adfærd, ikke ud fra deres nøjagtige molekylvægt. To forskellige forbindelser kan have lignende retentionstider, detekteres på samme måde ved UV-detektion eller endda delvist co-elueres. En høj hovedtop er derfor et godt tegn på renhed, men endnu ikke et bevis på, at prøven er netop det ønskede peptid.

Hvad HPLC pålideligt viser

Ved peptides anvendes der ofte omvendtfase-HPLC. Prøven løber gennem en hydrofob stationær fase, mens sammensætningen af den mobile fase ændrer sig. Afhængigt af hydrofobicitet, sekvens og biprodukter elueres komponenterne på forskellige tidspunkter. En UV-detektor, ofte ved 214 nm, registrerer toppene, og ud fra disse beregnes en procentvis fordeling af toparealet.

Dette er praktisk til at vurdere, om en prøve indeholder mange mindre komponenter eller fremstår som en enkelt dominerende top. Det er nyttigt til partikontrol, da synlige afvigelser hurtigt kan bemærkes. Enhver, der skal vurdere renheden, har næsten altid brug for HPLC som en del af analysen.

Hvad HPLC ikke kan give et sikkert svar på

HPLC kan dog ikke direkte angive, hvilken nøjagtig molekylmasse der ligger bag en top. Den bekræfter heller ikke et peptids sekvens. Et deletionsprodukt, en forkert indbygget aminosyre, en bivirkning fra syntesen eller et strukturelt lignende biprodukt kan se meget ens ud kromatografisk. Det samme gælder i tilfælde, hvor to forbindelser reagerer ens i UV-signalet.

• HPLC bekræfter ikke den nøjagtige molekylvægt.
• HPLC kan ikke pålideligt skelne mellem et rent hovedprodukt og medeluerende forbindelser.
• HPLC kan ikke påvise en aminosyresekvens.
• HPLC alene er ikke tilstrækkeligt til at fastslå, at et peptid er entydigt identificeret.

Det er netop derfor, at LC-MS anvendes til bestemmelse af peptididentitet. Så snart den kromatografiske adskillelse kombineres med massespektrometri, bliver et rent signal via HPLC/MS en egentlig identitetstest.

Hvordan LC-MS bekræfter et peptids identitet

LC-MS forener to styrker i én arbejdsgang: Først adskiller væskechromatografi prøven i dens bestanddele. Derefter måler massespektrometri ionerne i disse adskilte bestanddele. Resultatet er ikke blot en top ved en bestemt retentionstid, men også en massesignatur, der kan sammenlignes med den teoretiske peptidmasse.

Kromatografisk adskillelse før massespektrometri

LC-delen udfører fortsat en vigtig opgave. Den reducerer matrixeffekter, adskiller mindre komponenter fra hovedproduktet og bidrager til at sikre, at massespektret registreres specifikt for den relevante top. Dette er især vigtigt ved » peptides «, da salte, rester fra prøveforberedelsen eller strukturelt lignende biprodukter kan komplicere målingen.

LC-betingelserne skal være egnede til MS. Mens der ofte anvendes relativt store mængder TFA i UV-metoder, anvendes der i LC-MS ofte lavere koncentrationer eller mere MS-kompatible tilsætningsstoffer, så ioniseringen ikke hæmmes. Gode identifikationsdata starter derfor ikke kun i massespektrometeret, men allerede med en ren LC-metode.

Ionisering via ESI og måling af m/z

I massespektrometeret omdannes peptider ( peptides ) normalt til ladede ioner ved hjælp af elektrospray-ionisering, dvs. ESI. Denne ioniseringstype er særligt velegnet til peptid-massespektrometri ( peptides ), da den er relativt skånsom og ofte genererer flere ladningstilstande. Det er ikke en fejl, men helt normalt. Det samme peptid kan forekomme som et 2+-, 3+-, 4+- eller endda højere ladet ion.

Det, der måles, er ikke direkte molekylmassen i dalton, men masse-til-ladningsforholdet, m/z. Denne information udgør grundlaget for identitetsbekræftelsen. Ud fra flere matchende ladningstilstande kan peptidets faktiske molekylmasse derefter beregnes.

Sammenligning med den teoretiske peptidmasse

Kernen i peptididentifikationen ved LCMS er sammenligningen mellem den målte og den forventede masse. For et kendt peptid kan den teoretiske masse beregnes ud fra sekvensen, normalt som den monoisotopiske masse. Hvis de observerede signaler, den dekonvolverede masse, der udledes heraf, og isotopmønsteret stemmer overens med forventningerne, er det et stærkt tegn på identitet.

Målingen får særlig betydning, når flere faktorer spiller sammen:

• Hovedtoppen vises ved en klar, sandsynlig retentionstid
• De observerede m/z-signaler tilhører meningsfulde ladningstilstande for målpeptidet
• den dekonvolverede molekylmasse stemmer overens med den teoretiske masse
• Masseforskellen angives tydeligt i Da eller ppm
• dataene er knyttet til et unikt parti eller en unik prøve

LC-MS giver således netop svaret på det spørgsmål, som HPLC lader stå åbent: Er hovedkomponenten ikke blot klart adskilt, men også rent faktisk det forventede peptid?

m/z, ladningstilstande og dekonvolution forklaret på en enkel måde

En almindelig udfordring ved fortolkningen af LC-MS-data er, at instrumentet ikke direkte angiver et enkelt tal for molmassen. I stedet vises der flere toppe for forskellige ladningstilstande. Dette er helt normalt for peptides , da de kan optage flere protoner ved ESI.

Forenklet: m/z = (M + zH) / z. I praksis betyder det: Jo højere ladningen z er, desto lavere er den målte m/z-værdi. Et større peptid kan derfor forekomme med en højere ladning i et lignende m/z-interval som et mindre peptid med en lavere ladning. Kun en samlet vurdering af flere ladningstilstande giver den faktiske masse.

Dekonvolution reducerer disse forskellige ladningstilstande til en enkelt molekylmasse. I en god LCMS-rapport bør der derfor ikke blot være synlige individuelle m/z-toppe, men også peptidets samlede masse, der er beregnet ud fra disse. For brugerne er denne dekonvolverede masse som regel den vigtigste identifikationsværdi.

Når LC-MS/MS eller peptidkortlægning er nødvendigt

En kontrol af den intakte masse ved hjælp af LC-MS giver allerede mange oplysninger om mange syntetiske peptides. Der er dog tilfælde, hvor den intakte masse alene ikke er tilstrækkelig. Dette gælder blandt andet mere komplekse sekvenser, længere peptides, visse modifikationer eller situationer, hvor to strukturer kan have samme eller næsten samme masse.

I sådanne tilfælde giver LC-MS/MS en mere grundig identitetsbekræftelse. Her fragmenteres et udvalgt forløberion, og de resulterende fragmentioner måles. Ud fra disse mønstre, der ofte betegnes som b-ioner og y-ioner, kan man udlede, om sekvensen stemmer overens med det forventede peptid.

Hvad LC-MS/MS bidrager med

LC-MS bekræfter primært den intakte masse. LC-MS/MS går et skridt videre og undersøger strukturen gennem fragmentering. Dette er især værdifuldt, når ikke blot massen, men selve sekvensen skal fastslås. Ved længere peptides eller mere krævende analyser kan det udgøre forskellen mellem en god sandsynlighed og en virkelig robust identitetsbestemmelse.

LC-MS/MS er også en fornuftig metode, når der kan forventes biprodukter tæt på sekvensen. En enkelt masseværdi kan passe, men kun fragmentmønsteret viser, om byggestenene befinder sig på de rigtige positioner. Denne form for bekræftelse ligger tættere på en sekvenskontrol end på en simpel sammenligning af intakte masser.

Peptidkortlægning af større eller mere komplekse molekyler

For proteiner, antistoffer eller meget komplekse peptides anvendes peptidkortlægning ofte. Udgangsmolekylet spaltes enzymatisk i definerede peptides, typisk med trypsin, og disse fragmenter analyseres derefter ved hjælp af LC-MS eller LC-MS/MS. Inden for bottom-up-proteomik er dette en standardmetode til at kontrollere primærstruktur, sekvensdækning og visse modifikationer.

For at opnå en pålidelig peptidkortlægning er prøveforberedelsen afgørende. Reduktion, alkylering og spaltning skal vælges således, at der dannes tilstrækkelige mængder af » peptides «, uden at det medfører unødvendige artefakter såsom oxidation eller deamidering. Netop derfor er de metodologiske detaljer i kortlægningsarbejdsgangene vigtigere end ved en simpel test af intakte masser.

LC-MS/MS eller peptidkortlægning er især nyttigt til:

• længere eller med flere modifikationer peptides
• sekvenser med et højt indhold af disulfidbindinger eller proteinlignende molekyler
• sammenligninger mellem referencemateriale og et ukendt parti
• spørgsmål vedrørende bekræftelse af sekvensen snarere end blot den samlede masse
• analyser, hvor positionsspecifikke ændringer er relevante

Hvad en meningsfuld LCMS-rapport eller COA bør indeholde

En identitetstest er kun så god som den dokumentation, der ligger til grund for den. Enhver, der vurderer identiteten af et LCMS-peptid, bør ikke nøjes med en generel udtalelse som »opfylder specifikationerne«. En solid rapport viser, hvad der er målt, hvordan det er målt, og hvordan tolkningen er udledt.

Obligatoriske oplysninger til en identitetstest med sporbarhed

• unik prøve-, parti- eller batch-ID
• betegnelse for peptidet og helst den forventede sekvens eller den teoretiske masse
• den anvendte metode, f.eks. LC-MS eller LC-MS/MS
• angivelse af ioniseringstypen, typisk ESI
• kromatogram med mærkning af den relevante top
• målede m/z-værdier og tilhørende ladningstilstande
• dekonvolueret molekylmasse
• sammenligning med den teoretiske masse med afvigelse i Da eller ppm
• måledato og helst metodeversion eller teststandard
• tydelig tilknytning af dataene til den testede batch

Hvis der også foreligger fragmenteringsdata fra LC-MS/MS, bør det fremgå tydeligt, hvilke fragmenter der underbygger sekvensbekræftelsen. Ved mere komplekse analyser er oplysninger om prøveforberedelsen også relevante, f.eks. nedbrydning, reduktion eller alkylering.

Hvordan man genkender en stærk eller svag rapport

Et COA, der udelukkende er baseret på HPLC, er ikke nødvendigvis værdiløst. Det kan være nyttigt til vurdering af renheden. For en egentlig identitetsbestemmelse er det dog fortsat ufuldstændigt, så længe der ikke foreligger massedata eller andre direkte strukturelle beviser.

Hvilken metode passer til hvilket mål?

Den rigtige metode afhænger af, hvilket spørgsmål man ønsker at besvare. Ikke alle analyser kræver samme analytiske dybde. Det afgørende er, om målet er renhed, intakt masse eller sekvensbekræftelse.

Typiske fejlkilder ved vurdering af peptididentitet

Selv et godt LC-MS-system leverer kun pålidelige identifikationsdata, når prøven, metoden og fortolkningen er korrekte. Nogle fejlkilder forekommer særligt ofte i praksis:

• Salte og addukter kan udvide spektret eller frembringe yderligere signaler.
• For meget TFA forbedrer ofte kromatografien, men kan forværre ESI-ioniseringen markant.
• Samtidigt udvaskede forbindelser gør det vanskeligere at identificere toppe og massesignaler entydigt.
• Forkert ladningstilordning fører til en fejlagtig dekonvolution og dermed til en forkert molekylmasse.
• Oxidation, deamidering eller andre nedbrydningsprocesser ændrer den målte masse og kan forekomme som biprodukter.
• Rester fra tidligere injektioner kan forårsage signaler, der ser ud som om de kommer udefra.
• At masserne er identiske eller næsten identiske, betyder ikke altid, at strukturen er identisk, og derfor er der i grænsetilfælde behov for LC-MS/MS.

Enhver, der anmoder om en LCMS-identitetstest, bør derfor på forhånd præcisere, hvor dybtgående analysen skal være. For nogle prøver er det tilstrækkeligt at bekræfte den intakte masse. For andre er det ikke muligt at give en pålidelig konklusion uden fragmentering eller kortlægning.

Ofte stillede spørgsmål om LCMS og peptididentitet

Kan HPLC alene bekræfte et peptids identitet?

Nej. HPLC alene bekræfter primært en prøves kromatografiske renhed og elueringsadfærd. Det er værdifuldt, men udgør ikke et direkte bevis for den nøjagtige molekylvægt eller sekvens. For at kunne fastslå den nøjagtige identitet kræves der som minimum massespektrometri, typisk LC-MS.

Hvad er forskellen mellem LC-MS og LC-MS/MS?

LC-MS måler en forbindelses intakte masse via dens m/z-signaler og den molekylære masse, der beregnes ud fra disse. LC-MS/MS fragmenterer desuden en udvalgt ion og analyserer de resulterende fragmenter. Dette giver LC-MS/MS flere oplysninger om struktur og sekvens end en ren måling af den intakte masse.

Hvilken massepræcision bør en LCMS-rapport angive?

Det afhænger af instrumentet og spørgsmålet. Ved højopløsningsmassespektrometri er ppm-værdier i enkeltcifrede områder ofte realistiske og meget informative. Ved enklere systemer kan man acceptere større tolerancer. Vigtigere end et fast tal er en gennemsigtig sammenligning mellem målværdi og faktisk værdi med en klart angivet afvigelse.

Hvorfor opstår der flere ladningstilstande ved » peptides «?

Peptides har flere protoneringssteder og optager ofte mere end én proton ved elektrospray-ionisering. De fremstår derfor ikke som en enkelt top, men som en fordeling over flere ladningstilstande. Denne multiple ladning er normal og gør det – især for større peptides – ofte overhovedet muligt at foretage en præcis måling i det relevante m/z-område.

Er ESI-MS eller MALDI-TOF bedst egnet til » peptides «?

Ved rutinemæssige LC-koblede identitetskontroller er ESI-MS som regel det oplagte valg, da det kan kombineres direkte med væskechromatografi og genererer flere ladningstilstande. MALDI-TOF er også nyttigt, men bygger på et andet måleprincip og anvendes i den løbende LC-baserede kvalitetskontrol sjældnere som standarderstatning for LC-MS.

Hvornår er en analyse af intakte masser tilstrækkelig, og hvornår er MS/MS nødvendigt?

En kontrol af den intakte masse er ofte tilstrækkelig, når der er tale om et velkarakteriseret, ikke alt for komplekst peptid, og det primære spørgsmål er, om den målte masse stemmer overens med målforbindelsen. MS/MS er nyttigt, når der er behov for yderligere sikkerhed om sekvensen, når modifikationer spiller en rolle, eller når strukturelt lignende forbindelser ikke kan adskilles analytisk med tilstrækkelig sikkerhed.

Hvorfor er et COA, der udelukkende er baseret på HPLC, problematisk med hensyn til identifikation?

For en COA, der udelukkende er baseret på HPLC, besvarer kun en del af spørgsmålet om kvalitet. Den kan vise, at en prøve ser kromatografisk ren ud, men ikke, at hovedtoppen rent faktisk er det ønskede peptid. Uden massedata mangler den direkte sammenhæng mellem toppen og molekylmassen. Det er fint nok med hensyn til renhed, men utilstrækkeligt med hensyn til identitet.

Hvad betyder sporbarhed af partier i forbindelse med en peptidtest?

Batchsporbarhed betyder, at måledataene entydigt kan henføres til en bestemt prøve eller et bestemt parti. En pålidelig rapport angiver derfor batch-ID, testdato og helst den anvendte metode. Uden denne henvisning har selv et teknisk set godt spektrum betydeligt mindre værdi i praksis.

Kan LC-MS altid skelne mellem isomerer eller meget ens sekvenser?

Ikke altid. LC-MS er velegnet til at bekræfte den intakte masse, men i grænsetilfælde kan identiske eller næsten identiske masser repræsentere forskellige strukturer. Hvis sådanne forskelle er analytisk relevante, er der normalt behov for LC-MS/MS sammen med en god kromatografisk adskillelse eller, i komplekse tilfælde, målrettet peptidkortlægning.

Der gælder derfor et klart princip for vurderingen af et peptids identitet ved hjælp af LC-MS: Renhed og identitet er ikke det samme. Enhver, der virkelig ønsker at vide, om et peptid stemmer overens med den forventede struktur, bør se efter LC-MS-data, tydelige masseforskelle og klar dokumentation for produktpartiet. Netop denne gennemsigtighed i uafhængige COA-test gør, at et simpelt tal i COA’en bliver til en pålidelig analytisk konklusion.