Идентифициране на пептиди чрез LC-MS: Как LC-MS потвърждава идентичността на даден пептид

Чистият пик при HPLC все още не доказва, че даден пептид наистина е очакваната молекула. За установяване на идентичността на пептида е от значение не само колко чиста изглежда пробата, но и дали измерената маса и, където е приложимо, фрагментният профил съответстват на целевата последователност. Именно в това отношение LC-MS има предимство пред обикновената проверка чрез HPLC.

Тестът за идентификация на LCMS за „ peptides “ съчетава хроматографско разделяне с масова спектрометрия. Това дава възможност да се провери дали пробата съответства на очакваната маса на пептида, дали отчетените стойности попадат в рамките на допустимите отклонения и дали сертификатът за анализ (COA) или протоколът от изпитването са действително достоверни. Това е от решаващо значение, особено за по-дълги, модифицирани или по-трудни за анализ пептиди peptides.

Защо само чистотата не е достатъчна

Много потребители обръщат внимание преди всичко на чистотата, определена чрез HPLC. Това е разбираемо, тъй като HPLC е утвърден и изключително полезен етап в контрола на качеството. Той показва как компонентите на пробата се разделят хроматографски и каква част от тях се проявява като основен пик. Това е ценна информация за оценката на примесите. За еднозначно установяване на идентичността обаче това не е достатъчно.

Причината е проста: HPLC разделя веществата според тяхното хроматографско поведение, а не според точната им молекулна маса. Две различни съединения могат да имат сходни времена на задържане, да се откриват по подобен начин при UV или дори частично да се коелуират. Следователно високият основен пик е добър показател за чистота, но все още не е доказателство, че пробата е точно желаният пептид.

Какво надеждно показва HPLC

При метода „ peptides “ често се използва HPLC с обратна фаза. Пробата преминава през хидрофобна стационарна фаза, докато съставът на мобилната фаза се променя. В зависимост от хидрофобността, последователността и страничните продукти, компонентите се елюират в различно време. Ултравиолетов детектор, често на дължина на вълната 214 nm, регистрира пиковете, а въз основа на тях се изчислява процентното разпределение на площта на пиковете.

Това е практичен метод за оценка дали дадена проба съдържа много второстепенни компоненти или се проявява като един-единствен доминиращ пик. Той е полезен за контрол на партидите, тъй като видимите отклонения се забелязват бързо. Всеки, който оценява чистотата, почти винаги се нуждае от HPLC като част от аналитичния процес.

На какво HPLC не може да даде категоричен отговор

Въпреки това, HPLC не може директно да определи коя точно молекулна маса се крие зад даден пик. Тя също така не потвърждава последователността на пептида. Продукт от делеция, неправилно вградена аминокиселина, странична реакция от синтеза или структурно сходен страничен продукт могат да изглеждат много подобно хроматографски. Същото важи и в случаите, когато две съединения реагират по подобен начин в УВ-сигнала.

• ХПЛХ не потвърждава точната молекулна маса.
• ХПЛЦ не позволява надеждно разграничаване между чист основен продукт и съелуиращи съединения.
• ХПЛЦ не доказва аминокиселинната последователност.
• Само по себе си HPLC не е достатъчно, за да се обяви, че даден пептид е идентифициран без съмнение.

Именно затова LC-MS се използва за идентифициране на пептиди. Когато хроматографското разделяне се съчетае с масова спектрометрия, сигналът за чистота се превръща в истински тест за идентичност чрез HPLC/MS.

Как LC-MS потвърждава идентичността на даден пептид

LC-MS съчетава две предимства в един работен процес: първо, течната хроматография разделя пробата на съставните ѝ части. След това масова спектрометрия измерва йоните на тези разделени съставки. Резултатът е не само пик при определено време на задържане, но и масова характеристика, която може да се сравни с теоретичната маса на пептида.

Хроматографско разделяне преди масова спектрометрия

LC-частта продължава да изпълнява важна задача. Тя намалява матричните ефекти, отделя второстепенните компоненти от основния продукт и спомага за гарантиране, че масовният спектър се записва конкретно за съответния пик. Това е особено важно при метода „ peptides “, тъй като солите, остатъците от подготовката на пробата или структурно сходните странични продукти могат да затруднят измерването.

Условията за течна хроматография (LC) трябва да са подходящи за масова спектрометрия (MS). Докато при UV-методите често се използват относително големи количества ТФА, при LC-MS често се прилагат по-ниски концентрации или добавки, по-съвместими с MS, за да не се потиска йонизацията. Ето защо получаването на надеждни данни за идентифициране започва не само в масс-спектрометъра, но още с изчистена LC-методика.

Йонизация чрез ESI и измерване на m/z

В масс-спектрометъра пептидите ( peptides ) обикновено се превръщат в заредени йони чрез електроспрей-йонизация (ESI). Този тип йонизация е особено подходящ за пептидите с висока степен на несиметричност ( peptides ), тъй като е сравнително щадящ и често генерира йони с различни заряди. Това не е грешка, а нормално явление. Един и същ пептид може да се появи като йон с заряд 2+, 3+, 4+ или дори по-висок.

Измерва се не толкова пряко молекулното тегло в далтони, колкото съотношението маса-заряд (m/z). Тази информация предоставя основата от сурови данни за потвърждаване на идентичността. От няколко съвпадащи зарядни състояния след това може да се изчисли действителното молекулно тегло на пептида.

Сравнение с теоретичната маса на пептида

В основата на идентифицирането на пептидите чрез LCMS стои сравнението между измерената и очакваната маса. За известен пептид теоретичната маса може да се изчисли въз основа на аминокиселинната последователност, обикновено като моноизотопна маса. Ако наблюдаваните сигнали, деконволюираната маса, изведена от тях, и изотопният профил съответстват на очакванията, това е силен сигнал за идентичност.

Измерването придобива особено голямо значение, когато няколко фактора се съчетаят:

• главният пик се появява при ясно изразено и правдоподобно време на задържане
• наблюдаваните m/z сигнали съответстват на значими зарядови състояния на целевия пептид
• деконволюираната молекулна маса съвпада с теоретичната маса
• разликата в масата е ясно посочена в Da или ppm
• данните се отнасят към конкретна партида или проба

По този начин LC-MS дава точен отговор на въпроса, който HPLC оставя отворен: дали основният компонент не само е ясно отделен, но и действително представлява очаквания пептид?

m/z, зарядови състояния и деконволюция, обяснени на достъпен език

Често срещано затруднение при интерпретирането на данни от LC-MS е, че апаратът не предоставя директно едно единствено число за моларната маса. Вместо това се наблюдават няколко пика, съответстващи на различни зарядови състояния. Това е напълно нормално за молекулите с неравномерно разпределение на заряда ( peptides ), тъй като те могат да поемат няколко протона при ESI.

Опростено: m/z = (M + zH) / z. На практика това означава: колкото по-голям е зарядът z, толкова по-ниска е измерената стойност на m/z. Поради това по-голям пептид може да се появи с по-висок заряд в същия диапазон на m/z, както по-малък пептид с по-нисък заряд. Единствено съвместната оценка на множество зарядни състояния дава действителната маса.

Деконволюцията редуцира тези различни зарядови състояния до една единствена молекулна маса. Ето защо в един добър LCMS доклад трябва да се виждат не само отделните m/z пикове, но и общата маса на пептида, изчислена въз основа на тях. За потребителите тази деконволюирана маса обикновено е най-важната стойност за идентифициране.

Когато е необходимо LC-MS/MS или пептидно картиране

Проверката на масата на цялата молекула чрез LC-MS вече е много информативна за много синтетични съединения peptides. Въпреки това има случаи, в които само масата на цялата молекула не е достатъчна. Към тях спадат по-сложните последователности, по-дългите peptides, определени модификации или ситуации, в които две структури могат да имат еднаква или почти еднаква маса.

В такива случаи LC-MS/MS осигурява по-задълбочено потвърждение на идентичността. При този метод избран прекурсор-йон се фрагментира и се измерват получените фрагментни йони. Въз основа на тези модели, често наричани b-йони и y-йони, може да се прецени дали последователността съответства на очаквания пептид.

Какво добавя LC-MS/MS

LC-MS потвърждава предимно масата на цялата молекула. LC-MS/MS отива една стъпка по-далеч и проучва структурата чрез фрагментация. Това е особено ценно, когато трябва да се установи не само масата, но и самата последователност. При по-дълги peptides или по-сложни анализи това може да бъде разликата между добра вероятност и наистина надеждно установяване на идентичността.

LC-MS/MS е подходящ метод и в случаите, когато се очакват странични продукти, близки по последователност. Една-единствена стойност на масата може да съвпада, но само фрагментният профил показва дали съставните елементи са разположени на правилните позиции. Този вид потвърждение е по-близък до проверка на последователността, отколкото до просто сравнение на масата на интактния молекул.

Пептидно картиране на по-големи или по-сложни молекули

При протеини, антитела или много сложни peptides често се използва пептидно картиране. Изходната молекула се разгражда ензимно на определени peptides, обикновено с трипсин, след което тези фрагменти се анализират чрез LC-MS или LC-MS/MS. В „отдолу-нагоре“ протеомиката това е стандартен подход за проверка на първичната структура, обхвата на последователността и определени модификации.

За надеждно картиране на пептидите подготовката на пробите е от решаващо значение. Редукцията, алкилирането и разграждането трябва да бъдат подбрани така, че да се генерират достатъчно пептидни фрагменти ( peptides ), без да се предизвикват ненужни артефакти като окисление или деамидиране. Именно поради това методологичните детайли в работните процеси по картиране са по-важни, отколкото при обикновен тест за интактна маса.

LC-MS/MS или пептидното картиране е особено полезно за:

• по-дълги или многократно модифицирани peptides
• последователности, богати на дисулфидни връзки, или протеиноподобни молекули
• сравнения между еталонния материал и неизвестна партида
• въпроси, свързани с потвърждаването на последователността, а не само с общата маса
• анализи, при които са от значение специфичните за дадена позиция модификации

Какво трябва да съдържа един пълноценен доклад на LCMS или COA

Качеството на теста за идентичност зависи изцяло от качеството на документацията му. Всеки, който оценява идентичността на пептидите на LCMS, не бива да се задоволява с общо твърдение от типа „отговаря на спецификацията“. Един изчерпателен доклад показва какво е било измерено, как е било измерено и как е достигнато заключението.

Задължителна информация за тест за проследяема идентичност

• уникален идентификационен номер на проба, партида или серия
• наименование на пептида и, в идеалния случай, очакваната аминокиселинна последователност или теоретичната маса
• използван метод, например LC-MS или LC-MS/MS
• уточняване на типа йонизация, обикновено ESI
• хроматограма с обозначение на съответния пик
• наблюдавани стойности на m/z и съответстващите им зарядни състояния
• деконволюционна молекулна маса
• сравнение с теоретичната маса с отклонение в Da или ppm
• дата на измерването и, в идеалния случай, версия на метода или стандарт за изпитване
• ясно присвояване на данните към тестваната партида

Ако са налице и данни за фрагментацията от LC-MS/MS, трябва да е ясно кои фрагменти подкрепят потвърждаването на последователността. При по-сложни тестове са от значение и подробностите относно подготовката на пробата, като например разграждане, редукция или алкилиране.

Как да разпознаем силен или слаб доклад

Сертификатът за анализ (COA), изготвен единствено въз основа на HPLC, не е автоматично безполезен. Той може да бъде полезен за оценка на чистотата. За да се потвърди истинската идентичност обаче, той остава непълен, докато липсват данни за масата или други преки структурни доказателства.

Кой метод е подходящ за коя цел?

Подходящият метод зависи от това на какъв въпрос искате да отговорите. Не всеки тест изисква еднаква аналитична задълбоченост. Важното е дали целта е чистота, запазване на масата или потвърждаване на последователността.

Типични източници на грешки при оценката на идентичността на пептидите

Дори една добра LC-MS система предоставя надеждни данни за идентифициране само когато пробата, методът и интерпретацията са правилни. Някои източници на грешки се срещат особено често в практиката:

• Солите и аддуктите могат да разширят спектъра или да генерират допълнителни сигнали.
• Прекалено голямото количество TFA често подобрява хроматографията, но може значително да влоши ESI-йонизацията.
• Съвместно елуиращите съединения затрудняват еднозначното определяне на пиковете и масовите сигнали.
• Неправилното присвояване на заряда води до неточна деконволюция и съответно до неточна молекулна маса.
• Окисляването, деамидирането или други процеси на разграждане променят измерената маса и могат да се появят като странични продукти.
• Остатъците от предишни инжекции могат да предизвикат сигнали, които изглеждат като чужди.
• Идентичните или почти идентични непокътнати маси не винаги означават идентична структура, поради което в граничните случаи е необходим LC-MS/MS.

Следователно всеки, който иска да направи LCMS анализ за идентифициране, трябва предварително да уточни до каква степен трябва да се задълбочи анализът. За някои проби е достатъчно да се потвърди масата на непокътнатите молекули. За други обаче не е възможно да се направи надеждно заключение без фрагментация или картиране.

Често задавани въпроси относно LCMS и идентифицирането на пептиди

Може ли само чрез HPLC да се потвърди идентичността на даден пептид?

Не. Сама по себе си HPLC потвърждава предимно хроматографската чистота и елуционните характеристики на пробата. Това е ценна информация, но не представлява пряко доказателство за точната молекулна маса или последователност. За да се установи със сигурност идентичността, е необходима поне масова спектрометрия, обикновено LC-MS.

Каква е разликата между LC-MS и LC-MS/MS?

LC-MS измерва масата на цялото съединение чрез неговите m/z сигнали и молекулното тегло, изчислено въз основа на тях. LC-MS/MS допълнително фрагментира избран йон и анализира получените фрагменти. По този начин LC-MS/MS предоставя повече информация за структурата и последователността, отколкото обикновената проверка на масата на цялото съединение.

Каква точност на масата трябва да бъде посочена в LCMS доклада?

Това зависи от апаратурата и от въпроса. При масс-спектрометрията с висока разделителна способност често са реалистични и много информативни диапазони от единици ppm. При по-опростени системи могат да се приемат по-големи допустими отклонения. По-важно от конкретна цифра е прозрачното сравнение между целевата и действителната стойност с ясно посочено отклонение.

Защо при „ peptides “ се наблюдават множество зарядни състояния?

Peptides имат няколко протонатируеми места и често приемат повече от един протон при електроспрей-йонизация. Поради това те не се проявяват като един-единствен пик, а като разпределение в няколко зарядни състояния. Това многократно зареждане е нормално и, при по-големи молекули peptides, често изобщо прави възможно получаването на ясно измерване в съответния m/z диапазон.

Коя техника е по-подходяща за анализ на левкоцитни епитопи ( peptides) – ESI-MS или MALDI-TOF?

За рутинни проверки на идентичността, съчетани с течна хроматография (LC), ESI-MS обикновено е очевидният избор, тъй като може да се комбинира директно с течна хроматография и генерира множество зарядни състояния. MALDI-TOF също е полезен, но се основава на различен принцип на измерване и при текущия контрол на качеството, базиран на LC, се използва по-рядко като стандартен заместител на LC-MS.

Кога е достатъчна проверка на интактната маса и кога е необходима MS/MS?

Проверката на интактната маса често е достатъчна, когато се работи с добре охарактеризиран, не твърде сложен пептид, а основният въпрос е дали измерената маса съответства на целевото съединение. MS/MS е полезен, когато е необходима допълнителна сигурност относно последователността, когато модификациите са от значение или когато структурно сходните съединения не се разделят аналитично с достатъчна степен на сигурност.

Защо сертификатът за анализ (COA), изготвен единствено въз основа на HPLC, представлява проблем по отношение на идентичността?

Защото сертификатът за анализ (COA), изготвен само въз основа на HPLC, дава отговор само на част от въпроса за качеството. Той може да покаже, че пробата изглежда хроматографски чиста, но не и че основният пик наистина е желаният пептид. Без данни за масата липсва пряката връзка между пика и молекулното тегло. Това е достатъчно за определяне на чистотата, но не е пълно за установяване на идентичността.

Какво означава проследимостта на партидата при тест за пептиди?

Проследимостта на партидите означава, че измерените данни са еднозначно привързани към конкретна проба или партида. Ето защо един надежден доклад трябва да съдържа идентификационния номер на партидата, датата на изпитването и, в идеалния случай, използвания метод. Без това привързване дори един технически добър спектър на практика има значително по-малка стойност.

Може ли LC-MS винаги да разграничава изомери или много сходни последователности?

Не винаги. LC-MS е ефективен метод за потвърждаване на масата на интактните молекули, но в гранични случаи еднакви или почти еднакви маси могат да съответстват на различни структури. Ако тези разлики са аналитично значими, обикновено се налага използването на LC-MS/MS, съчетано с добро хроматографско разделяне или, в сложни случаи, целенасочено картиране на пептидите.

Следователно при оценката на идентичността на пептидите чрез LC-MS важи един ясен принцип: чистотата и идентичността не са едно и също нещо. Всеки, който наистина иска да знае дали даден пептид съответства на очакваната структура, трябва да търси данни от LC-MS, прозрачни разлики в масата и изчерпателна документация за партидата. Именно тази прозрачност в независимите тестове на сертификата за анализ (COA) превръща едно обикновено число в сертификата в надеждно аналитично заключение.