Identyfikacja peptydów metodą LC-MS: Jak za pomocą LC-MS potwierdza się obecność peptydu

Czysty pik w HPLC nie stanowi jeszcze dowodu na to, że peptyd jest rzeczywiście oczekiwaną cząsteczką. W przypadku identyfikacji peptydów liczy się nie tylko to, jak czysta wydaje się próbka, ale także to, czy zmierzona masa oraz – w stosownych przypadkach – wzór fragmentacji odpowiadają sekwencji docelowej. Właśnie w tym zakresie metoda LC-MS przewyższa zwykłą kontrolę metodą HPLC.

Test identyfikacyjny LCMS dla peptydów typu „ peptides ” łączy separację chromatograficzną ze spektrometrią masową. Dzięki temu można sprawdzić, czy próbka odpowiada oczekiwanej masie peptydu, czy odczyty mieszczą się w realistycznych granicach tolerancji oraz czy certyfikat analizy (COA) lub raport z badań mają rzeczywiste znaczenie. Ma to kluczowe znaczenie, zwłaszcza w przypadku dłuższych, zmodyfikowanych lub trudniejszych do analizy peptydów typu „ peptides ”.

Dlaczego sama czystość to za mało

Wielu użytkowników zwraca uwagę przede wszystkim na czystość określoną metodą HPLC. Jest to zrozumiałe, ponieważ HPLC stanowi ugruntowany i bardzo przydatny etap kontroli jakości. Metoda ta pokazuje, w jaki sposób składniki próbki rozdzielają się chromatograficznie oraz jaki udział stanowi główny pik. Jest to cenne przy ocenie zanieczyszczeń. Nie wystarcza to jednak do jednoznacznego określenia tożsamości substancji.

Powód jest prosty: w metodzie HPLC substancje są rozdzielane na podstawie ich właściwości chromatograficznych, a nie dokładnej masy cząsteczkowej. Dwa różne związki mogą wykazywać podobne czasy retencji, być wykrywane w podobny sposób w promieniowaniu UV, a nawet częściowo koelucjonować. Wysoki pik główny jest zatem dobrym wskaźnikiem czystości, ale nie stanowi jeszcze dowodu na to, że próbka jest dokładnie tym peptydem, którego szukamy.

Co niezawodnie wykazuje HPLC

W przypadku analizy typu „ peptides ” często stosuje się HPLC w fazie odwróconej. Próbka przepływa przez hydrofobową fazę stacjonarną, podczas gdy skład fazy ruchomej ulega zmianom. W zależności od hydrofobowości, sekwencji i produktów ubocznych poszczególne składniki ulegają elucji w różnym czasie. Detektor UV, często o długości fali 214 nm, rejestruje piki, na podstawie których obliczany jest procentowy rozkład powierzchni pików.

Jest to praktyczne rozwiązanie pozwalające ocenić, czy próbka zawiera wiele składników o niewielkiej zawartości, czy też występuje w postaci jednego dominującego piku. Jest to przydatne w kontroli partii, ponieważ widoczne odchylenia można szybko zauważyć. Każdy, kto ocenia czystość, prawie zawsze potrzebuje HPLC jako części procesu analitycznego.

Na jakie pytania HPLC nie potrafi udzielić jednoznacznej odpowiedzi

Jednak metoda HPLC nie pozwala bezpośrednio określić, jaka dokładnie masa cząsteczkowa odpowiada danemu pikowi. Nie potwierdza ona również sekwencji peptydu. Produkt delecji, błędnie wbudowany aminokwas, reakcja uboczna powstała podczas syntezy lub produkt uboczny o podobnej strukturze mogą wyglądać bardzo podobnie w analizie chromatograficznej. To samo dotyczy przypadków, w których dwa związki wykazują podobną reakcję w sygnale UV.

• Metoda HPLC nie pozwala na określenie dokładnej masy cząsteczkowej.
• HPLC nie pozwala w sposób wiarygodny odróżnić czystego produktu głównego od związków współelucujących.
• HPLC nie pozwala ustalić sekwencji aminokwasowej.
• Sama metoda HPLC nie wystarcza, by uznać peptyd za jednoznacznie zidentyfikowany.

Właśnie dlatego metoda LC-MS jest wykorzystywana do identyfikacji peptydów. Gdy tylko rozdzielenie chromatograficzne zostanie połączone ze spektrometrią masową, czysty sygnał czystości staje się prawdziwym testem identyfikacyjnym w ramach analizy HPLC/MS.

W jaki sposób metoda LC-MS pozwala potwierdzić tożsamość peptydu

Metoda LC-MS łączy dwie zalety w jednym procesie: najpierw chromatografia cieczowa rozdziela próbkę na poszczególne składniki, a następnie spektrometria masowa mierzy jony tych rozdzielonych składników. Wynikiem jest nie tylko pik przy określonym czasie retencji, ale także sygnatura masowa, którą można porównać z teoretyczną masą peptydu.

Rozdzielenie chromatograficzne przed analizą spektrometrii masowej

Część LC nadal pełni ważną funkcję. Ogranicza ona efekty matrycowe, oddziela składniki uboczne od głównego produktu oraz pomaga zapewnić, że widmo masowe jest rejestrowane wyłącznie dla danego piku. Ma to szczególne znaczenie w przypadku spektrometrii masowej typu „ peptides ”, ponieważ sole, pozostałości po przygotowaniu próbki lub produkty uboczne o podobnej strukturze mogą utrudniać pomiar.

Warunki LC muszą być dostosowane do MS. Podczas gdy w metodach UV często stosuje się stosunkowo duże ilości TFA, w LC-MS często wykorzystuje się niższe stężenia lub dodatki bardziej kompatybilne z MS, aby nie hamować jonizacji. Dlatego też uzyskanie dobrych danych identyfikacyjnych zaczyna się nie tylko w spektrometrze masowym, ale już od czystej metody LC.

Jonizacja metodą ESI i pomiar stosunku mas do ładunku (m/z)

W spektrometrze masowym cząsteczki peptides ne są zazwyczaj przekształcane w naładowane jony poprzez jonizację elektrospryskową (ESI). Ten rodzaj jonizacji jest szczególnie odpowiedni w przypadku metod analizy peptydów ( peptides ), ponieważ jest stosunkowo łagodny i często powoduje powstanie jonów o różnych stopniach naładowania. Nie jest to błąd, lecz normalne zjawisko. Ten sam peptyd może występować jako jon o naładowaniu 2+, 3+, 4+ lub nawet wyższym.

Nie mierzy się bezpośrednio masy cząsteczkowej w daltonach, lecz stosunek masy do ładunku, m/z. Informacja ta stanowi podstawę danych surowych służących do potwierdzenia tożsamości. Na podstawie wielu pasujących stanów ładunkowych można następnie obliczyć rzeczywistą masę cząsteczkową peptydu.

Porównanie z teoretyczną masą peptydu

Podstawą identyfikacji peptydów metodą LCMS jest porównanie zmierzonej masy z masą oczekiwaną. W przypadku znanego peptydu masę teoretyczną można obliczyć na podstawie sekwencji, zazwyczaj jako masę monoisotopową. Jeśli obserwowane sygnały, wyliczona na ich podstawie masa oraz wzór izotopowy są zgodne z oczekiwaniami, stanowi to silny sygnał potwierdzający tożsamość.

Pomiar nabiera szczególnego znaczenia, gdy kilka czynników współgra ze sobą:

• główny pik pojawia się przy wyraźnym, wiarygodnym czasie retencji
• zaobserwowane sygnały m/z odpowiadają istotnym stanom ładunkowym peptydu docelowego
• masa cząsteczkowa po dekonwolucji pokrywa się z masą teoretyczną
• różnica mas jest jasno podana w Da lub ppm
• dane są przypisane do konkretnej partii lub próbki

W ten sposób LC-MS udziela jednoznacznej odpowiedzi na pytanie, na które HPLC nie daje jednoznacznej odpowiedzi: czy główny składnik jest nie tylko wyraźnie oddzielony, ale czy rzeczywiście jest to oczekiwany peptyd?

m/z, stany ładunku i dekonwolucja – proste wyjaśnienie

Częstą trudnością przy interpretacji danych LC-MS jest to, że przyrząd nie podaje bezpośrednio jednej wartości liczbowej masy molowej. Zamiast tego pojawia się kilka pików odpowiadających różnym stanom ładunku. Jest to całkowicie normalne w przypadku cząsteczek typu „ peptides ”, ponieważ w procesie ESI mogą one przyjąć kilka protonów.

W uproszczeniu: m/z = (M + zH) / z. W praktyce oznacza to, że im wyższy ładunek z, tym niższa jest zmierzona wartość m/z. Większy peptyd może zatem, przy wyższym ładunku, pojawić się w podobnym przedziale m/z co mniejszy peptyd o niższym ładunku. Tylko łączna ocena wielu stanów ładunkowych pozwala uzyskać rzeczywistą masę.

Dekonwolucja sprowadza te różne stany ładunku do jednej masy cząsteczkowej. Dlatego w rzetelnym raporcie LCMS powinny być widoczne nie tylko poszczególne piki m/z, ale także całkowita masa peptydu obliczona na ich podstawie. Dla użytkowników ta masa uzyskana w wyniku dekonwolucji jest zazwyczaj najważniejszą wartością identyfikacyjną.

Gdy konieczne jest zastosowanie LC-MS/MS lub mapowania peptydów

Ocena masy nienaruszonej metodą LC-MS dostarcza już wielu cennych informacji w przypadku wielu związków syntetycznych peptides. Istnieją jednak przypadki, w których sama masa nienaruszona nie jest wystarczająca. Należą do nich bardziej złożone sekwencje, dłuższe peptides, pewne modyfikacje lub sytuacje, w których dwie struktury mogą mieć taką samą lub niemal taką samą masę.

W takich przypadkach metoda LC-MS/MS zapewnia dokładniejsze potwierdzenie tożsamości. Polega to na fragmentacji wybranego jonu prekursorowego i pomiarze powstałych jonów fragmentacyjnych. Na podstawie tych wzorców, często określanych jako jony b i jony y, można ustalić, czy sekwencja jest zgodna z oczekiwanym peptydem.

Co wnosi metoda LC-MS/MS

Metoda LC-MS służy przede wszystkim do potwierdzenia masy cząsteczki w stanie nienaruszonym. Metoda LC-MS/MS idzie o krok dalej i pozwala zbadać strukturę poprzez fragmentację. Jest to szczególnie cenne w sytuacjach, gdy konieczne jest ustalenie nie tylko masy, ale i samej sekwencji. W przypadku dłuższych peptides lub bardziej wymagających analiz może to stanowić różnicę między dobrą wiarygodnością a naprawdę solidnym stwierdzeniem tożsamości.

Metoda LC-MS/MS ma również sens w sytuacjach, gdy można spodziewać się produktów ubocznych o sekwencji zbliżonej do badanej. Pojedyncza wartość masy może pasować, ale tylko wzór fragmentów pozwala stwierdzić, czy elementy składowe znajdują się we właściwych pozycjach. Ten rodzaj potwierdzenia jest bliższy weryfikacji sekwencji niż prostemu porównaniu masy cząsteczki nienaruszonej.

Mapowanie peptydowe w przypadku większych lub bardziej złożonych cząsteczek

W przypadku białek, przeciwciał lub bardzo złożonych peptides często stosuje się mapowanie peptydowe. Cząsteczkę wyjściową rozszczepia się enzymatycznie na określone peptides, zazwyczaj za pomocą trypsyny, a powstałe fragmenty są następnie analizowane metodą LC-MS lub LC-MS/MS. W proteomice typu „bottom-up” jest to standardowe podejście służące do weryfikacji struktury pierwszorzędowej, pokrycia sekwencji oraz niektórych modyfikacji.

Aby uzyskać wiarygodne mapowanie peptydów, kluczowe znaczenie ma przygotowanie próbki. Należy tak dobrać procesy redukcji, alkilacji i trawienia, aby wygenerować wystarczającą liczbę fragmentów o masie charakterystycznej ( peptides ), nie powodując przy tym niepożądanych artefaktów, takich jak utlenianie czy deamidacja. Właśnie dlatego szczegóły metodologiczne w procesach mapowania mają większe znaczenie niż w przypadku zwykłego badania mas nienaruszonych.

Metoda LC-MS/MS lub mapowanie peptydów jest szczególnie przydatna w następujących przypadkach:

• dłuższe lub wielokrotnie zmodyfikowane peptides
• sekwencje bogate w mostki disiarczkowe lub cząsteczki o budowie podobnej do białek
• porównania między materiałem odniesienia a nieznaną partią
• kwestie związane z potwierdzeniem sekwencji, a nie tylko z ogólną masą
• analizy, w których istotne są modyfikacje specyficzne dla danej pozycji

Co powinien zawierać merytoryczny raport LCMS lub COA

Wiarygodność testu identyfikacyjnego zależy od jakości jego dokumentacji. Każdy, kto ocenia zgodność peptydów LCMS, nie powinien zadowalać się ogólnikowym stwierdzeniem typu „spełnia wymagania specyfikacji”. Rzetelny raport zawiera informacje o tym, co zmierzono, w jaki sposób przeprowadzono pomiary oraz na jakiej podstawie dokonano interpretacji wyników.

Informacje obowiązkowe dotyczące badania identyfikacji umożliwiającego śledzenie pochodzenia

• unikalny identyfikator próbki, partii lub serii
• nazwa peptydu oraz, w miarę możliwości, przewidywana sekwencja lub masa teoretyczna
• zastosowana metoda, na przykład LC-MS lub LC-MS/MS
• określenie typu jonizacji, zazwyczaj ESI
• chromatogram z oznaczeniem odpowiedniego piku
• zarejestrowane wartości m/z i odpowiadające im stany ładunku
• masa cząsteczkowa po dekonwolucji
• porównanie z masą teoretyczną wraz z odchyleniem wyrażonym w Da lub ppm
• data pomiaru oraz, w miarę możliwości, wersja metody lub norma badawcza
• jasne przyporządkowanie danych do badanej partii

Jeśli dostępne są również dane dotyczące fragmentacji uzyskane metodą LC-MS/MS, należy jasno wskazać, które fragmenty potwierdzają sekwencję. W przypadku bardziej złożonych badań istotne są również szczegóły dotyczące przygotowania próbki, takie jak trawienie, redukcja lub alkilowanie.

Jak rozpoznać dobry lub słaby raport

Certyfikat analizy (COA) oparty wyłącznie na analizie HPLC nie jest z założenia bezwartościowy. Może on być przydatny do oceny czystości. Jednak w celu potwierdzenia prawdziwej tożsamości substancji pozostaje on niekompletny, dopóki nie zostaną przedstawione dane masowe lub inne bezpośrednie dowody strukturalne.

Która metoda najlepiej pasuje do danego celu?

Wybór odpowiedniej metody zależy od tego, na jakie pytanie chcesz uzyskać odpowiedź. Nie każdy test wymaga takiego samego poziomu szczegółowości analizy. Liczy się to, czy celem jest uzyskanie czystego produktu, zachowanie masy cząsteczki czy potwierdzenie sekwencji.

Typowe źródła błędów przy ocenie identyczności peptydów

Nawet dobry system LC-MS zapewnia wiarygodne dane identyfikacyjne tylko wtedy, gdy próbka, metoda i interpretacja są prawidłowe. Niektóre źródła błędów występują w praktyce szczególnie często:

• Sole i addukty mogą poszerzyć spektrum lub wywołać dodatkowe sygnały.
• Zbyt duża ilość TFA często poprawia wyniki chromatografii, ale może znacznie pogorszyć jonizację ESI.
• Związki współelucujące utrudniają jednoznaczne przyporządkowanie pików do sygnałów masowych.
• Nieprawidłowe przypisanie ładunku prowadzi do błędnej dekonwolucji, a tym samym do uzyskania nieprawidłowej masy cząsteczkowej.
• Utlenianie, deamidacja lub inne procesy degradacji powodują zmianę mierzonej masy i mogą występować jako produkty uboczne.
• Pozostałości po poprzednich wstrzyknięciach mogą powodować sygnały, które wydają się pochodzić z zewnętrznego źródła.
• Identyczne lub niemal identyczne masy substancji w stanie nienaruszonym nie zawsze oznaczają identyczną strukturę, dlatego w przypadkach granicznych konieczne jest zastosowanie metody LC-MS/MS.

Każdy, kto zamawia badanie identyfikacyjne metodą LCMS, powinien zatem z wyprzedzeniem sprecyzować, jak szczegółowa ma być analiza. W przypadku niektórych próbek wystarczy potwierdzenie masy nienaruszonej. W przypadku innych nie da się sformułować wiarygodnego wniosku bez przeprowadzenia analizy fragmentacji lub mapowania.

Najczęściej zadawane pytania dotyczące LCMS i identyfikacji peptydów

Czy sama metoda HPLC pozwala potwierdzić tożsamość peptydu?

Nie. Sama metoda HPLC służy przede wszystkim do potwierdzenia czystości chromatograficznej oraz charakterystyki elucji próbki. Jest to cenna informacja, ale nie stanowi bezpośredniego dowodu dokładnej masy cząsteczkowej ani sekwencji. Aby uzyskać pewność co do tożsamości substancji, konieczne jest co najmniej zastosowanie spektrometrii masowej, zazwyczaj w postaci LC-MS.

Jaka jest różnica między LC-MS a LC-MS/MS?

Metoda LC-MS pozwala zmierzyć masę nienaruszonego związku na podstawie sygnałów m/z oraz obliczonej na ich podstawie masy cząsteczkowej. Metoda LC-MS/MS dodatkowo powoduje fragmentację wybranego jonu i analizuje powstałe fragmenty. Dzięki temu metoda LC-MS/MS dostarcza więcej informacji o strukturze i sekwencji niż sama analiza masy nienaruszonego związku.

Jaką dokładność pomiaru masy powinien wykazywać raport LCMS?

To zależy od przyrządu i od pytania. W przypadku spektrometrii masowej o wysokiej rozdzielczości zakresy rzędu pojedynczych cyfr w ppm są często realistyczne i bardzo miarodajne. W przypadku prostszych systemów można zaakceptować większe tolerancje. Ważniejsze od sztywnej wartości liczbowej jest przejrzyste porównanie wartości docelowej z rzeczywistą, z jasno określonym odchyleniem.

Dlaczego w przypadku „ peptides ” występują różne stany naładowania?

Peptides posiadają kilka miejsc protonowalnych i często przyjmują więcej niż jeden proton podczas jonizacji elektrospryskowej. W związku z tym nie pojawiają się one jako pojedynczy pik, lecz jako rozkład obejmujący kilka stanów ładunkowych. Takie wielokrotne ładowanie jest zjawiskiem normalnym i, w przypadku większych cząsteczek peptides, często w ogóle umożliwia uzyskanie czystego pomiaru w odpowiednim zakresie m/z.

Czy w przypadku analizy „ peptides ” lepsza jest metoda ESI-MS czy MALDI-TOF?

W przypadku rutynowych kontroli tożsamości połączonych z chromatografią cieczową (LC) metodą ESI-MS jest zazwyczaj oczywistym wyborem, ponieważ można ją bezpośrednio połączyć z chromatografią cieczową i pozwala ona na generowanie wielu stanów ładunkowych. Metoda MALDI-TOF jest również przydatna, ale opiera się na innej zasadzie pomiaru i w ramach bieżącej kontroli jakości opartej na chromatografii cieczowej jest rzadziej stosowana jako standardowy zamiennik LC-MS.

Kiedy wystarczy analiza masy substancji w postaci niezmienionej, a kiedy konieczne jest zastosowanie metody MS/MS?

W przypadku dobrze scharakteryzowanego, niezbyt złożonego peptydu często wystarcza sprawdzenie masy całkowitej, a głównym zagadnieniem jest to, czy zmierzona masa odpowiada docelowemu związkowi. Metoda MS/MS jest przydatna, gdy potrzebna jest dodatkowa pewność co do sekwencji, gdy istotne są modyfikacje lub gdy związki o podobnej strukturze nie są rozdzielane analitycznie z wystarczającą pewnością.

Dlaczego certyfikat analizy (COA) oparty wyłącznie na analizie HPLC stanowi problem w kontekście identyfikacji?

Ponieważ certyfikat analizy (COA) oparty wyłącznie na HPLC odpowiada jedynie na część pytania dotyczącego jakości. Może on wykazać, że próbka wygląda na czystą pod względem chromatograficznym, ale nie potwierdza, że główny pik rzeczywiście odpowiada poszukiwanemu peptydowi. Bez danych masowych brakuje bezpośredniego powiązania między pikiem a masą cząsteczkową. To wystarcza do oceny czystości, ale jest niewystarczające do ustalenia tożsamości.

Co oznacza identyfikowalność partii w przypadku testu peptydowego?

Identyfikowalność partii oznacza, że zmierzone dane są jednoznacznie przypisane do konkretnej próbki lub partii. W związku z tym rzetelny raport zawiera numer partii, datę badania oraz – w idealnym przypadku – zastosowaną metodę. Bez takiego przypisania nawet spektrum o dobrej jakości technicznej ma w praktyce znacznie mniejszą wartość.

Czy metoda LC-MS zawsze pozwala na rozróżnienie izomerów lub bardzo podobnych sekwencji?

Nie zawsze. Metoda LC-MS doskonale sprawdza się w potwierdzaniu masy cząsteczki w stanie nienaruszonym, jednak w przypadkach granicznych te same lub niemal identyczne masy mogą odpowiadać różnym strukturom. Jeśli różnice te mają znaczenie analityczne, zazwyczaj konieczne jest zastosowanie metody LC-MS/MS w połączeniu z dobrą separacją chromatograficzną lub, w złożonych przypadkach, ukierunkowanym mapowaniem peptydów.

W związku z tym przy ocenie zgodności peptydów metodą LC-MS obowiązuje jasna zasada: czystość i zgodność to nie to samo. Każdy, kto naprawdę chce wiedzieć, czy peptyd odpowiada oczekiwanej strukturze, powinien zwrócić uwagę na dane LC-MS, przejrzyste różnice masowe oraz rzetelną dokumentację partii. Właśnie ta przejrzystość w niezależnych testach certyfikatu analizy (COA) sprawia, że zwykła liczba podana w certyfikacie staje się wiarygodnym oświadczeniem analitycznym.