Identificação de péptidos por LC-MS: Como a LC-MS confirma um péptido

Um pico de HPLC nítido ainda não prova que um péptido seja realmente a molécula esperada. Para determinar a identidade de um péptido, o que importa não é apenas o grau de pureza aparente da amostra, mas sim se a massa medida e, quando aplicável, o padrão de fragmentação correspondem à sequência-alvo. É precisamente neste aspeto que a LC-MS se revela superior a uma análise por HPLC pura.

Um teste de identificação LCMS para o « peptides » combina a separação cromatográfica com a espectrometria de massa. Isto permite verificar se a amostra corresponde à massa esperada do péptido, se os valores obtidos se situam dentro de tolerâncias plausíveis e se um Certificado de Análise (COA) ou um relatório de ensaio é, de facto, significativo. Isto é crucial, especialmente no caso de « peptides » mais longos, modificados ou mais desafiantes do ponto de vista analítico.

Por que razão a pureza, por si só, não é suficiente

Muitos utilizadores têm em conta, em primeiro lugar, a pureza determinada por HPLC. Isso é compreensível, uma vez que a HPLC é uma etapa consolidada e muito útil no controlo de qualidade. Mostra como os componentes de uma amostra se separam cromatograficamente e qual a proporção que surge como pico principal. Isso é valioso para avaliar as impurezas. No entanto, para uma identificação inequívoca, não é suficiente.

A razão é simples: a HPLC separa as substâncias com base no seu comportamento cromatográfico, e não na sua massa molecular exata. Dois compostos diferentes podem apresentar tempos de retenção semelhantes, ser detetados de forma semelhante no UV ou até mesmo co-eluir parcialmente. Um pico principal elevado é, portanto, um bom indicador de pureza, mas ainda não constitui prova de que a amostra seja exatamente o péptido pretendido.

O que a HPLC revela de forma fiável

Na análise de « peptides », recorre-se frequentemente à HPLC de fase inversa. A amostra passa por uma fase estacionária hidrofóbica, enquanto a composição da fase móvel varia. Dependendo da hidrofobicidade, da sequência e dos subprodutos, os componentes são eluídos em momentos diferentes. Um detetor UV, frequentemente a 214 nm, capta os picos, a partir dos quais se calcula a distribuição percentual da área dos picos.

Isto é prático para avaliar se uma amostra contém muitos componentes menores ou se se apresenta como um único pico dominante. É útil para o controlo de lotes, uma vez que os desvios visíveis são rapidamente percetíveis. Quem avalia a pureza necessita quase sempre da HPLC como parte da análise.

O que a HPLC não consegue responder com certeza

No entanto, a HPLC não permite determinar diretamente qual é a massa molecular exata subjacente a um pico. Também não confirma a sequência de um péptido. Um produto de deleção, um aminoácido incorporado incorretamente, uma reação colateral da síntese ou um subproduto estruturalmente semelhante podem apresentar um aspeto muito semelhante na cromatografia. O mesmo se aplica nos casos em que dois compostos apresentam uma resposta semelhante no sinal UV.

• A HPLC não confirma uma massa molecular exata.
• A HPLC não permite distinguir de forma fiável entre um produto principal puro e compostos que co-eluem.
• A HPLC não permite determinar a sequência de aminoácidos.
• A HPLC, por si só, não é suficiente para considerar que um péptido foi identificado de forma inequívoca.

É precisamente por isso que a LC-MS é utilizada para determinar a identidade dos péptidos. Assim que a separação cromatográfica é combinada com a espectrometria de massa, um sinal de pureza torna-se um verdadeiro teste de identidade através da HPLC/MS.

Como a LC-MS confirma a identidade de um péptido

A LC-MS combina dois pontos fortes num único fluxo de trabalho: em primeiro lugar, a cromatografia líquida separa a amostra nos seus componentes. Em seguida, a espectrometria de massa mede os iões desses componentes separados. O resultado não é apenas um pico num determinado tempo de retenção, mas também uma assinatura de massa que pode ser comparada com a massa teórica do péptido.

Separação cromatográfica antes da espectrometria de massa

A parte LC continua a desempenhar uma função importante. Reduz os efeitos de matriz, separa os componentes secundários do produto principal e ajuda a garantir que o espectro de massa seja adquirido especificamente para o pico relevante. Isto é especialmente importante no caso d peptides, uma vez que sais, resíduos da preparação da amostra ou subprodutos estruturalmente semelhantes podem complicar a medição.

As condições de LC têm de ser adequadas para MS. Embora nos métodos UV sejam frequentemente utilizadas quantidades relativamente elevadas de TFA, a LC-MS recorre frequentemente a concentrações mais baixas ou a aditivos mais compatíveis com a MS, para que a ionização não seja suprimida. Por conseguinte, a obtenção de dados de identificação fiáveis não começa apenas no espectrómetro de massa, mas já com um método de LC adequado.

Ionização por ESI e medição de m/z

No espectrómetro de massa, os peptides es são normalmente convertidos em iões carregados através da ionização por electrospray, ou seja, ESI. Este tipo de ionização é particularmente adequado para o método « peptides », uma vez que é relativamente suave e gera frequentemente múltiplos estados de carga. Isso não é um erro, mas sim normal. O mesmo peptídeo pode aparecer como um ião com carga 2+, 3+, 4+ ou mesmo superior.

O que se mede não é diretamente a massa molecular em daltons, mas sim a relação massa/carga, m/z. Esta informação constitui a base de dados brutos para a confirmação da identidade. A partir de vários estados de carga correspondentes, é então possível calcular a massa molecular real do péptido.

Comparação com a massa teórica do péptido

O cerne da identificação de péptidos por LCMS reside na comparação entre a massa medida e a massa esperada. No caso de um péptido conhecido, a massa teórica pode ser calculada a partir da sequência, normalmente como massa monoisotópica. Se os sinais observados, a massa deconvoluída deles derivada e o padrão isotópico corresponderem às expectativas, isso constitui um forte indício de identificação.

A medição torna-se particularmente significativa quando vários elementos se encaixam:

• o pico principal surge com um tempo de retenção nítido e plausível
• os sinais de m/z observados correspondem a estados de carga significativos do péptido alvo
• a massa molecular deconvoluída corresponde à massa teórica
• a diferença de massa é indicada de forma clara em Da ou ppm
• os dados são atribuídos a um lote ou amostra únicos

Assim, a LC-MS responde exatamente à questão que a HPLC deixa em aberto: será que o componente principal não só está bem separado, como é, de facto, o péptido esperado?

m/z, estados de carga e deconvolução explicados de forma simples

Um obstáculo comum na interpretação de dados de LC-MS é o facto de o instrumento não apresentar diretamente um único valor para a massa molar. Em vez disso, surgem vários picos correspondentes a diferentes estados de carga. Isto é perfeitamente normal no caso d peptides , uma vez que estas podem absorver vários protões na ESI.

De forma simplificada: m/z = (M + zH) / z. Na prática, isto significa que: quanto maior for a carga z, menor será o valor de m/z medido. Um péptido maior pode, portanto, apresentar uma carga mais elevada numa gama de m/z semelhante à de um péptido mais pequeno com uma carga mais baixa. Apenas a avaliação conjunta de vários estados de carga permite determinar a massa real.

A deconvolução reduz estes diferentes estados de carga a uma única massa molecular. Num bom relatório de LCMS, portanto, não só os picos m/z individuais devem ser visíveis, mas também a massa global do péptido calculada a partir deles. Para os utilizadores, esta massa deconvoluída é normalmente o valor de identificação mais importante.

Quando é necessário recorrer à LC-MS/MS ou ao mapeamento de péptidos

Uma análise da massa intacta por LC-MS já é bastante informativa para muitos compostos sintéticos peptides. No entanto, há casos em que a massa intacta, por si só, não é suficiente. Entre estes incluem-se sequências mais complexas, cadeias mais longas peptides, certas modificações ou situações em que duas estruturas podem ter a mesma massa ou uma massa quase idêntica.

Nesses casos, a LC-MS/MS permite uma confirmação mais aprofundada da identidade. Neste processo, um ião precursor selecionado é fragmentado e os iões fragmentados resultantes são medidos. A partir destes padrões, frequentemente descritos como iões b e iões y, é possível inferir se a sequência é consistente com o péptido esperado.

O que a LC-MS/MS acrescenta

A LC-MS confirma, principalmente, a massa intacta. A LC-MS/MS vai um passo além e investiga a estrutura através da fragmentação. Isto é especialmente valioso quando é necessário determinar não só a massa, mas também a própria sequência. No caso de análises mais longas peptides ou mais exigentes, isso pode fazer a diferença entre uma boa plausibilidade e uma determinação de identidade verdadeiramente robusta.

A LC-MS/MS também se justifica quando se prevê a existência de subprodutos próximos na sequência. Um único valor de massa pode corresponder, mas só o padrão de fragmentos revela se os blocos de construção se encontram nas posições corretas. Este tipo de confirmação assemelha-se mais a uma verificação da sequência do que a uma simples comparação da massa intacta.

Mapeamento de péptidos para moléculas maiores ou mais complexas

No caso de proteínas, anticorpos ou moléculas muito complexas peptides, recorre-se frequentemente ao mapeamento de péptidos. A molécula inicial é clivada enzimaticamente em fragmentos definidos peptides, normalmente com tripsina, e esses fragmentos são depois analisados por LC-MS ou LC-MS/MS. Na proteómica bottom-up, esta é uma abordagem padrão para verificar a estrutura primária, a cobertura da sequência e certas modificações.

Para um mapeamento robusto de péptidos, a preparação da amostra é crucial. A redução, a alquilação e a digestão devem ser selecionadas de forma a gerar um número suficiente de « peptides » (peptídeos de mapeamento), sem promover artefactos desnecessários, tais como oxidação ou desamidação. É precisamente por isso que os detalhes metodológicos nos fluxos de trabalho de mapeamento são mais importantes do que num simples teste de massa intacta.

A LC-MS/MS ou o mapeamento de péptidos é particularmente útil para:

• mais longos ou com múltiplas modificações peptides
• sequências ricas em pontes dissulfureto ou moléculas semelhantes a proteínas
• comparações entre o material de referência e um lote desconhecido
• questões relacionadas com a confirmação da sequência, em vez de apenas com a massa total
• análises em que as modificações específicas de cada posição são relevantes

O que um relatório LCMS ou COA significativo deve conter

A qualidade de um teste de identidade depende inteiramente da sua documentação. Quem avaliar a identidade de um péptido por LCMS não deve contentar-se com uma afirmação genérica como «cumpre as especificações». Um relatório rigoroso indica o que foi medido, como foi medido e como se chegou à interpretação.

Informações obrigatórias para um teste de identidade rastreável

• identificador único de amostra, lote ou série
• designação do péptido e, idealmente, a sequência esperada ou a massa teórica
• método utilizado, por exemplo, LC-MS ou LC-MS/MS
• especificação do tipo de ionização, normalmente ESI
• cromatograma com identificação do pico relevante
• valores de m/z observados e estados de carga associados
• massa molecular deconvoluída
• comparação com a massa teórica, com desvio em Da ou ppm
• data da medição e, idealmente, a versão do método ou a norma de ensaio
• atribuição clara dos dados ao lote testado

Se também estiverem disponíveis dados de fragmentação obtidos por LC-MS/MS, deve ficar claro quais os fragmentos que sustentam a confirmação da sequência. No caso de ensaios mais complexos, os pormenores relativos à preparação da amostra também são relevantes, tais como a digestão, a redução ou a alquilação.

Como reconhecer um relatório sólido ou fraco

Um COA baseado exclusivamente em HPLC não é, por si só, sem valor. Pode ser útil para avaliar a pureza. No entanto, para uma declaração de identidade verdadeira, continua a ser incompleto enquanto não forem apresentados dados de massa ou outras provas estruturais diretas.

Qual é o método mais adequado para cada objetivo?

O método adequado depende da questão a que se pretende responder. Nem todos os testes exigem o mesmo nível de profundidade analítica. O que importa é se o objetivo é a pureza, a massa intacta ou a confirmação da sequência.

Fontes típicas de erro na avaliação da identidade dos péptidos

Mesmo um bom sistema de LC-MS só fornece dados de identificação fiáveis quando a amostra, o método e a interpretação estão corretos. Algumas fontes de erro ocorrem com especial frequência na prática:

• Os sais e os adutos podem alargar o espectro ou gerar sinais adicionais.
• Uma quantidade excessiva de TFA melhora frequentemente a cromatografia, mas pode prejudicar significativamente a ionização por ESI.
• Os compostos que co-eluem dificultam a identificação clara dos picos e dos sinais de massa.
• A atribuição incorreta de carga leva a uma deconvolução errada e, consequentemente, a uma massa molecular incorreta.
• A oxidação, a desamidação ou outros processos de degradação alteram a massa medida e podem surgir como subprodutos.
• Resíduos de injeções anteriores podem causar sinais aparentemente estranhos.
• Massas intactas idênticas ou quase idênticas nem sempre implicam uma estrutura idêntica, razão pela qual a LC-MS/MS é necessária em casos limítrofes.

Quem solicitar um teste de identificação por LCMS deve, por isso, esclarecer antecipadamente até que ponto a análise deve ir. Para algumas amostras, basta a confirmação da massa intacta. Para outras, não é possível obter uma conclusão fiável sem fragmentação ou mapeamento.

Perguntas frequentes sobre LCMS e a identificação de péptidos

A HPLC, por si só, permite confirmar a identidade de um péptido?

Não. A HPLC, por si só, confirma principalmente a pureza cromatográfica e o comportamento de eluição de uma amostra. Isso é valioso, mas não constitui uma prova direta da massa molecular exata nem da sequência. Para uma determinação definitiva da identidade, é necessária, no mínimo, a espectrometria de massa, normalmente a LC-MS.

Qual é a diferença entre LC-MS e LC-MS/MS?

A LC-MS mede a massa intacta de um composto através dos seus sinais m/z e da massa molecular calculada a partir destes. A LC-MS/MS fragmenta, além disso, um ião selecionado e analisa os fragmentos resultantes. Isto permite que a LC-MS/MS forneça mais informações sobre a estrutura e a sequência do que uma simples análise da massa intacta.

Que precisão de massa deve constar num relatório de LCMS?

Isso depende do instrumento e da questão. Com a espectrometria de massa de alta resolução, intervalos de ppm de um único dígito são frequentemente realistas e muito informativos. Com sistemas mais simples, podem ser aceites tolerâncias mais amplas. Mais importante do que um valor rígido é uma comparação transparente entre o valor pretendido e o valor real, com um desvio claramente indicado.

Por que razão ocorrem vários estados de carga com o « peptides »?

Peptides possuem vários sítios protonáveis e, frequentemente, captam mais do que um protão na ionização por electrospray. Por conseguinte, não aparecem como um único pico, mas sim como uma distribuição por vários estados de carga. Esta carga múltipla é normal e, no caso de peptides maiores, torna frequentemente possível, em primeiro lugar, uma medição nítida na gama de m/z adequada.

O que é melhor para o « peptides »: o ESI-MS ou o MALDI-TOF?

Para verificações de identidade de rotina acopladas à cromatografia líquida (LC), a ESI-MS é normalmente a escolha óbvia, uma vez que pode ser combinada diretamente com a cromatografia líquida e gera múltiplos estados de carga. A MALDI-TOF também é útil, mas segue um princípio de medição diferente e, no controlo de qualidade contínuo baseado em LC, é menos utilizada como substituto padrão da LC-MS.

Quando é que uma análise de massa intacta é suficiente e quando é que é necessária a MS/MS?

Uma verificação da massa intacta é frequentemente suficiente quando se lida com um péptido bem caracterizado e não demasiado complexo, e a questão principal é se a massa medida corresponde ao composto alvo. A MS/MS é útil quando é necessária uma maior certeza quanto à sequência, quando as modificações são relevantes ou quando compostos estruturalmente semelhantes não são separados analiticamente com confiança suficiente.

Por que razão um COA baseado exclusivamente em HPLC é problemático para a identificação?

Porque um certificado de análise (COA) baseado apenas em HPLC responde apenas a uma parte da questão da qualidade. Pode mostrar que uma amostra parece cromatograficamente limpa, mas não que o pico principal seja realmente o péptido pretendido. Sem dados de massa, falta a ligação direta entre o pico e a massa molecular. É suficiente para avaliar a pureza, mas incompleto para determinar a identidade.

O que significa «rastreabilidade do lote» num teste de péptidos?

A rastreabilidade do lote significa que os dados medidos são atribuídos de forma inequívoca a uma amostra ou lote específico. Por conseguinte, um relatório rigoroso deve indicar o número de identificação do lote, a data do ensaio e, idealmente, o método utilizado. Sem esta atribuição, mesmo um espectro tecnicamente válido tem um valor significativamente menor na prática.

Será que a LC-MS consegue sempre distinguir isómeros ou sequências muito semelhantes?

Nem sempre. A LC-MS é eficaz na confirmação da massa intacta, mas, em casos limítrofes, massas iguais ou quase iguais podem corresponder a estruturas diferentes. Se essas diferenças forem analiticamente relevantes, é normalmente necessário recorrer à LC-MS/MS, juntamente com uma boa separação cromatográfica ou, em casos complexos, ao mapeamento específico de péptidos.

Aplica-se, portanto, um princípio claro à avaliação da identidade dos péptidos por LC-MS: pureza e identidade não são a mesma coisa. Quem quiser realmente saber se um péptido corresponde à estrutura esperada deve procurar dados de LC-MS, diferenças de massa transparentes e documentação clara sobre o lote. É precisamente esta transparência nos testes independentes do COA que transforma um mero número no COA numa declaração analítica robusta.