Peptidin tunnistaminen LC-MS-menetelmällä: Miten LC-MS-menetelmällä vahvistetaan peptidi

Puhdas HPLC-piikki ei vielä todista, että peptidi on todellakin odotettu molekyyli. Peptidin tunnistamisen kannalta ratkaisevaa ei ole pelkästään se, kuinka puhtaalta näyte näyttää, vaan se, vastaavatko mitattu massa ja tarvittaessa fragmenttikuva kohdesekvenssiä. Juuri tässä LC-MS on parempi kuin pelkkä HPLC-tarkastus.

peptides :n LCMS-tunnistustesti yhdistää kromatografisen erottelun ja massaspektrometrian. Tämän avulla voidaan tarkistaa, vastaako näyte odotettua peptidimassaa, ovatko mittaustulokset uskottavien toleranssien rajoissa ja onko COA-todistus tai testiraportti todella merkityksellinen. Tämä on ratkaisevan tärkeää erityisesti pidempien, modifioitujen tai analyyttisesti haastavampien peptidien peptides kohdalla.

Miksi puhtaus yksinään ei riitä

Monet käyttäjät kiinnittävät ensisijaisesti huomiota HPLC-puhdistusasteeseen. Tämä on ymmärrettävää, sillä HPLC on vakiintunut ja erittäin hyödyllinen vaihe laadunvalvonnassa. Se osoittaa, miten näytteen komponentit erottuvat kromatografisesti ja mikä osuus niistä näkyy pääpiikkinä. Tämä on arvokasta epäpuhtauksien arvioinnissa. Yksiselitteisen tunnistuksen kannalta se ei kuitenkaan riitä.

Syy on yksinkertainen: HPLC erottaa aineet niiden kromatografisen käyttäytymisen perusteella, ei niiden tarkan molekyylimassan perusteella. Kahdella eri yhdisteellä voi olla samanlaiset retentioajat, ne voivat näkyä samalla tavalla UV-spektrissä tai jopa eluoitua osittain samanaikaisesti. Korkea pääpiikki on siis hyvä merkki puhtaudesta, mutta se ei vielä todista, että näyte on juuri haluttu peptidi.

Mitä HPLC osoittaa luotettavasti

peptides-menetelmässä käytetään usein käänteisfaasi-HPLC:tä. Näyte kulkee hydrofobisen stationäärivaiheen läpi, samalla kun liikkuvan faasin koostumus muuttuu. Komponentit eluoituvat eri aikoina riippuen niiden hydrofobisuudesta, sekvenssistä ja sivutuotteista. UV-detektori, usein aallonpituudella 214 nm, tallentaa piikit, ja niiden perusteella lasketaan piikkialueiden prosentuaalinen jakauma.

Tämä on käytännöllistä arvioitaessa, sisältääkö näyte paljon pienempiä komponentteja vai näkyykö se yhtenä hallitsevana piikkinä. Se on hyödyllistä eränvalvonnassa, koska näkyvät poikkeamat havaitaan nopeasti. Puhtautta arvioiva tarvitsee lähes aina HPLC:tä osana analytiikkaa.

Mihin HPLC ei pysty antamaan varmaa vastausta

HPLC:llä ei kuitenkaan voida suoraan määrittää, mikä tarkka molekyylimassa piikin takana on. Se ei myöskään vahvista peptidin sekvenssiä. Deleetiotuote, virheellisesti sisällytetty aminohappo, synteesin sivureaktio tai rakenteellisesti samankaltainen sivutuote voivat näyttää kromatografisesti hyvin samankaltaisilta. Sama pätee tilanteissa, joissa kaksi yhdistettä reagoivat samankaltaisesti UV-signaalissa.

• HPLC-menetelmällä ei voida määrittää tarkkaa molekyylimassaa.
• HPLC:llä ei voida luotettavasti erottaa puhdasta päätuotetta samanaikaisesti eluoituvista yhdisteistä.
• HPLC-menetelmällä ei voida todentaa aminohapposekvenssiä.
• Pelkkä HPLC-analyysi ei riitä todistamaan, että peptidi on tunnistettu yksiselitteisesti.

Juuri tästä syystä LC-MS:ää käytetään peptidien tunnistamiseen. Heti kun kromatografinen erottelu yhdistetään massaspektrometriaan, puhdas signaali muuttuu HPLC/MS:n avulla todelliseksi tunnistustestiksi.

Miten LC-MS-menetelmällä varmistetaan peptidin identiteetti

LC-MS yhdistää kaksi vahvuutta yhteen työnkulkuun: ensinnäkin nestekromatografia erottaa näytteen sen komponentteihin. Sen jälkeen massaspektrometria mittaa näiden erotettujen komponenttien ionit. Tuloksena ei ole pelkästään piikki tietyllä retentioajalla, vaan myös massasignatuuri, jota voidaan verrata peptidin teoreettiseen massaan.

Kromatografinen erottelu ennen massaspektrometriaa

LC-osa hoitaa edelleen tärkeän tehtävän. Se vähentää matriisivaikutuksia, erottaa vähäiset komponentit päätuotteesta ja auttaa varmistamaan, että massaspektri mitataan nimenomaan kyseisen piikin osalta. Tämä on erityisen tärkeää peptides, sillä suolat, näytteenvalmistuksesta jääneet jäännökset tai rakenteeltaan samankaltaiset sivutuotteet voivat vaikeuttaa mittausta.

LC-olosuhteiden on sovelluttava massaspektrometriaan. Vaikka UV-menetelmissä käytetään usein suhteellisen suuria määriä TFA:ta, LC-MS-menetelmissä käytetään usein pienempiä pitoisuuksia tai massaspektrometriaan paremmin sopivia lisäaineita, jotta ionisaatiota ei estetä. Hyvät tunnistustulokset eivät siis ala vasta massaspektrometristä, vaan jo puhtaasta LC-menetelmästä.

Ionisaatio ESI-menetelmällä ja m/z-arvon mittaus

Massaspektrometrissä peptidit ( peptides ) muutetaan yleensä varautuneiksi ioneiksi elektrospray-ionisaation (ESI) avulla. Tämä ionisaatiomenetelmä sopii erityisen hyvin peptidien ( peptides ) analysointiin, koska se on suhteellisen hellävaraista ja tuottaa usein useita varausasteita. Tämä ei ole virhe, vaan normaalia. Sama peptidi voi esiintyä 2+, 3+, 4+ tai jopa korkeammin varautuneena ionina.

Mitattavana ei ole suoraan molekyylimassa daltoneina, vaan massa-varaus-suhde, m/z. Tämä tieto muodostaa raakatietopohjan identiteetin vahvistamiselle. Useista vastaavista varausasteista voidaan sitten laskea peptidin todellinen molekyylimassa.

Vertailu teoreettiseen peptidimassaan

LCMS-peptidien tunnistamisen ydin on mitatun ja odotetun massan vertailu. Tunnetun peptidin osalta teoreettinen massa voidaan laskea sekvenssin perusteella, yleensä monoisotooppisena massana. Jos havaitut signaalit, niistä johdettu dekonvoluutioitu massa ja isotooppikuvio vastaavat odotuksia, se on vahva tunnistusmerkki.

Mittauksesta tulee erityisen merkityksellinen, kun useat seikat sopivat yhteen:

• pääpiikki näkyy selkeällä, uskottavalla retentioajalla
• havaittujen m/z-signaalien arvojen perusteella kyseessä ovat kohdepeptidin tunnistettavat varausasteet
• dekonvoluutioitu molekyylimassa vastaa teoreettista massaa
• massan ero ilmoitetaan selkeästi yksiköissä Da tai ppm
• tiedot on liitetty tiettyyn erään tai näytteeseen

Näin ollen LC-MS antaa tarkan vastauksen juuri siihen kysymykseen, johon HPLC ei anna vastausta: Onko pääkomponentti paitsi erottunut selvästi, myös todellakin odotettu peptidi?

m/z, varausasteet ja dekonvoluutio selitettynä yksinkertaisesti

Yleinen ongelma LC-MS-tietojen tulkinnassa on se, että laite ei anna suoraan yhtä ainoaa lukua moolimassaksi. Sen sijaan eri varausasteille näkyy useita piikkejä. Tämä on täysin normaalia ” peptides ” -yhdisteille, koska ne voivat ottaa vastaan useita protoneja ESI-menetelmässä.

Yksinkertaistettuna: m/z = (M + zH) / z. Käytännössä tämä tarkoittaa seuraavaa: mitä suurempi varaus z on, sitä pienempi on mitattu m/z-arvo. Suurempi peptidi voi siten näkyä suuremmalla varauksella samankaltaisella m/z-alueella kuin pienempi peptidi, jolla on pienempi varaus. Vain useiden varausasteiden yhteisarviointi antaa todellisen massan.

Dekonvoluutio yhdistää nämä erilaiset varausasteet takaisin yhdeksi molekyylimassaksi. Hyvässä LCMS-raportissa tulisi siis näkyä paitsi yksittäiset m/z-huiput myös niiden perusteella laskettu peptidin kokonaismassa. Käyttäjille tämä dekonvoluutioitu massa on yleensä tärkein tunnistusarvo.

Kun LC-MS/MS-analyysi tai peptidikartoitus on tarpeen

LC-MS-menetelmällä suoritettu ehjän massan tarkistus antaa jo hyvin paljon tietoa monien synteettisten yhdisteiden osalta peptides. On kuitenkin tapauksia, joissa pelkkä ehjän massan mittaus ei riitä. Tällaisia ovat monimutkaisemmat sekvenssit, pidemmät peptides, tietyt modifikaatiot tai tilanteet, joissa kahdella rakenteella voi olla sama tai lähes sama massa.

Tällaisissa tapauksissa LC-MS/MS tarjoaa perusteellisemman tunnistuksen. Menetelmässä valittu esiaste-ioni hajotetaan ja syntyneet fragmentti-ionit mitataan. Näiden kuvioiden perusteella – joita usein kutsutaan b-ioneiksi ja y-ioneiksi – voidaan päätellä, vastaako sekvenssi odotettua peptidiä.

Mitä LC-MS/MS tuo mukanaan

LC-MS vahvistaa ensisijaisesti molekyylin kokonaisen massan. LC-MS/MS menee askeleen pidemmälle ja selvittää rakenteen fragmentaation avulla. Tämä on erityisen arvokasta silloin, kun on varmistettava paitsi massa myös itse sekvenssi. Pidempien peptides tai vaativampien analyysien kohdalla tämä voi olla ratkaiseva tekijä hyvän todennäköisyyden ja todella luotettavan tunnistustuloksen välillä.

LC-MS/MS on järkevä valinta myös silloin, kun on odotettavissa sekvenssin läheisyydessä olevia sivutuotteita. Yksi ainoa massaarvo saattaa sopia, mutta vain fragmenttikuva paljastaa, ovatko rakennuspalikat oikeilla paikoillaan. Tällainen vahvistus muistuttaa enemmän sekvenssin tarkistusta kuin pelkkää ehjän molekyylin massan vertailua.

Peptidikartoitus suuremmille tai monimutkaisemmille molekyyleille

Proteiinien, vasta-aineiden tai erittäin monimutkaisten peptides tapauksessa käytetään usein peptidikartoitusta. Lähtömolekyyli pilkotaan entsymaattisesti määriteltyihin peptides, tyypillisesti trypsiinillä, ja nämä fragmentit analysoidaan sitten LC-MS- tai LC-MS/MS-menetelmällä. Bottom-up-proteomiikassa tämä on vakiintunut menetelmä primaarisen rakenteen, sekvenssipeiton ja tiettyjen modifikaatioiden tarkastamiseksi.

Luotettavan peptidikartoituksen kannalta näytteen valmistelu on ratkaisevan tärkeää. Reduktio, alkylointi ja pilkkominen on valittava siten, että syntyy riittävästi peptides ilman, että ne aiheuttavat tarpeettomia artefakteja, kuten hapettumista tai deamidoitumista. Juuri tästä syystä kartoitusprosessien menetelmälliset yksityiskohdat ovat tärkeämpiä kuin yksinkertaisessa ehjän massan mittauksessa.

LC-MS/MS-menetelmä eli peptidikartoitus on erityisen hyödyllinen seuraavissa tapauksissa:

• pidemmät tai moninkertaisesti muokatut peptides
• disulfidipitoiset sekvenssit tai proteiinin kaltaiset molekyylit
• vertailut vertailuaineen ja tuntemattoman erän välillä
• kysymykset sekvenssin vahvistamisesta eikä pelkästään kokonaismassasta
• analyysit, joissa paikkakohtaiset muutokset ovat merkityksellisiä

Mitä merkityksellisen LCMS-raportin tai COA:n tulisi sisältää

Identiteettitestin laatu riippuu täysin sen dokumentaatiosta. LCMS-peptidin identiteettiä arvioivan henkilön ei tulisi tyytyä yleisluontoiseen toteamukseen, kuten ”täyttää vaatimukset”. Kattava raportti kertoo, mitä mitattiin, miten se mitattiin ja miten tulkinta on johdettu.

Jäljitettävän identiteettitestin pakolliset tiedot

• yksilöllinen näyte-, erä- tai tuotantoerän tunniste
• peptidin nimi ja mieluiten sen odotettu sekvenssi tai teoreettinen massa
• käytetty menetelmä, esimerkiksi LC-MS tai LC-MS/MS
• ionisaatiotyypin määrittely, tyypillisesti ESI
• kromatogrammi, jossa merkitty kyseinen piikki
• havaitut m/z-arvot ja niihin liittyvät varausasteet
• dekonvoluutioitu molekyylimassa
• vertailu teoreettiseen massaan, poikkeama ilmaistuna Da:na tai ppm:nä
• mittauspäivämäärä ja mieluiten menetelmän versio tai testausstandardi
• tietojen selkeä kohdentaminen testattavaan erään

Jos LC-MS/MS-menetelmällä saadut fragmentaatiotiedot ovat myös käytettävissä, tulisi olla selvää, mitkä fragmentit tukevat sekvenssin vahvistamista. Monimutkaisemmissa testeissä myös näytteenvalmistuksen yksityiskohdat, kuten pilkkominen, pelkistys tai alkylointi, ovat merkityksellisiä.

Miten tunnistaa vahva tai heikko raportti

Pelkästään HPLC-menetelmällä laadittu COA ei ole automaattisesti arvoton. Se voi olla hyödyllinen puhtauden arvioinnissa. Todellisen identiteetin vahvistamiseksi se on kuitenkin puutteellinen niin kauan kuin massatietoja tai muuta suoraa rakenteellista näyttöä ei ole saatavilla.

Mikä menetelmä sopii mihinkin tavoitteeseen?

Oikea menetelmä riippuu siitä, mihin kysymykseen haluat vastata. Kaikissa testeissä ei tarvita yhtä syvällistä analyysia. Ratkaisevaa on, onko tavoitteena puhtaus, ehjä massa vai sekvenssin vahvistaminen.

Tyypillisiä virhelähteitä peptidien identiteetin arvioinnissa

Jopa hyvä LC-MS-järjestelmä tuottaa luotettavaa tunnistustietoa vain, jos näyte, menetelmä ja tulkinta ovat oikein. Jotkin virhelähteet esiintyvät käytännössä erityisen usein:

• Suolat ja adduktit voivat laajentaa spektriä tai tuottaa uusia signaaleja.
• Liian suuri TFA-pitoisuus parantaa usein kromatografiaa, mutta voi heikentää ESI-ionisaatiota huomattavasti.
• Yhdessä eluoituvat yhdisteet vaikeuttavat piikin ja massasignaalin tarkkaa tunnistamista.
• Virheellinen varauksen määrittäminen johtaa virheelliseen dekonvoluutioon ja siten virheelliseen molekyylimassaan.
• Hapettuminen, deamidoituminen tai muut hajoamisprosessit muuttavat mitattua massaa ja voivat ilmetä sivutuotteina.
• Aikaisemmista injektioista jääneet aineet voivat aiheuttaa näennäisesti vieraita signaaleja.
• Täysin samat tai lähes samat ehjät massat eivät aina tarkoita täysin samaa rakennetta, minkä vuoksi raja-tapauksissa tarvitaan LC-MS/MS-menetelmää.

Siksi jokaisen, joka pyytää LCMS-identiteettitestiä, tulisi selvittää etukäteen, kuinka perusteellisen analyysin on oltava. Joissakin näytteissä riittää, että vahvistetaan ehjän molekyylin massa. Toisissa tapauksissa luotettavaa johtopäätöstä ei voida tehdä ilman fragmentointia tai kartoitusta.

Usein kysyttyjä kysymyksiä LCMS:stä ja peptidien tunnistamisesta

Voidaanko peptidin identiteetti vahvistaa pelkästään HPLC:n avulla?

Ei. Pelkästään HPLC:llä vahvistetaan ensisijaisesti näytteen kromatografinen puhtaus ja eluointikäyttäytyminen. Tämä on arvokasta tietoa, mutta se ei ole suoraa näyttöä tarkan molekyylimassan tai sekvenssin osalta. Todellisen identiteetin vahvistamiseksi tarvitaan vähintään massaspektrometriaa, tyypillisesti LC-MS:ää.

Mikä ero on LC-MS:n ja LC-MS/MS:n välillä?

LC-MS mittaa yhdisteen ehjän massan sen m/z-signaalien ja niistä lasketun molekyylimassan avulla. LC-MS/MS hajottaa lisäksi valitun ionin ja tutkii syntyneitä fragmentteja. Näin LC-MS/MS tarjoaa enemmän rakenne- ja sekvenssitietoa kuin pelkkä ehjän massan mittaus.

Minkälaisen massatarkkuuden LCMS-raportin tulisi osoittaa?

Se riippuu mittauslaitteesta ja kysymyksestä. Korkean resoluution massaspektrometrian avulla yksinumeroiset ppm-arvot ovat usein realistisia ja erittäin informatiivisia. Yksinkertaisemmissa järjestelmissä voidaan hyväksyä suurempia toleransseja. Tärkeämpää kuin tarkka luku on läpinäkyvä vertailu tavoitearvon ja todellisen arvon välillä, jossa poikkeama on selvästi ilmoitettu.

Miksi peptides:ssa esiintyy useita varausasteita?

Peptides niissä on useita protonoituvia kohtia, ja ne ottavat usein vastaan useamman kuin yhden protonin elektrospray-ionisaatiossa. Siksi ne eivät näy yhtenä piikkinä, vaan jakautuvat useisiin varausasteisiin. Tämä moninkertainen varautuminen on normaalia, ja suurempien peptides osalta se usein mahdollistaa puhtaan mittauksen asianmukaisella m/z-alueella jo lähtökohtaisesti.

Kumpi menetelmä, ESI-MS vai MALDI-TOF, sopii paremmin peptides-tutkimukseen?

Rutiininomaisissa LC-yhdistetyissä tunnistustarkastuksissa ESI-MS on yleensä ilmeinen valinta, koska se voidaan yhdistää suoraan nestekromatografiaan ja se tuottaa useita varausasteita. MALDI-TOF on myös hyödyllinen menetelmä, mutta se perustuu eri mittausperiaatteeseen, ja jatkuvassa LC-pohjaisessa laadunvalvonnassa sitä käytetään harvemmin LC-MS:n vakiovaihtoehtona.

Milloin intakti-massamittaus riittää ja milloin tarvitaan MS/MS-analyysiä?

Intact-mass-tarkistus riittää usein, kun kyseessä on hyvin karakterisoitu, ei liian monimutkainen peptidi ja pääasiallinen kysymys on, vastaako mitattu massa kohdeyhdisteen massaa. MS/MS on hyödyllinen, kun tarvitaan lisävarmuutta sekvenssistä, modifikaatioilla on merkitystä tai rakenteellisesti samankaltaisia yhdisteitä ei saada erotettua analyyttisesti riittävän luotettavasti.

Miksi pelkästään HPLC-menetelmällä laadittu COA on ongelmallinen lajin tunnistamisen kannalta?

Sillä pelkästään HPLC-menetelmällä laadittu analyysiraportti (COA) vastaa vain osittain laatuun liittyvään kysymykseen. Se voi osoittaa, että näyte näyttää kromatografisesti puhtaalta, mutta ei sitä, että pääpiikki on todellakin haluttu peptidi. Ilman massatietoja puuttuu suora yhteys piikin ja molekyylimassan välillä. Se riittää puhtauden arviointiin, mutta ei riitä tunnistamiseen.

Mitä erän jäljitettävyys tarkoittaa peptiditestissä?

Erän jäljitettävyys tarkoittaa, että mitatut tiedot on yksiselitteisesti liitetty tiettyyn näytteeseen tai erään. Hyvässä raportissa mainitaan siis erän tunniste, testauspäivämäärä ja mieluiten myös käytetty menetelmä. Ilman tätä liitosta jopa teknisesti hyvä spektri menettää käytännössä huomattavasti arvoaan.

Pystyykö LC-MS aina erottamaan isomeerit tai hyvin samankaltaiset sekvenssit toisistaan?

Ei aina. LC-MS on tehokas menetelmä ehjän massan vahvistamisessa, mutta samat tai lähes samat massat voivat rajatapauksissa edustaa erilaisia rakenteita. Jos tällaisilla eroilla on analyyttistä merkitystä, tarvitaan yleensä LC-MS/MS-menetelmää sekä hyvää kromatografista erottelua tai, monimutkaisissa tapauksissa, kohdennettua peptidikartoitusta.

LC-MS-peptidien identiteetin arvioinnissa pätee siis selkeä periaate: puhtaus ja identiteetti eivät ole sama asia. Jokaisen, joka todella haluaa tietää, vastaako peptidi odotettua rakennetta, tulisi tarkastella LC-MS-tietoja, selkeitä massoeroja ja selkeää eräasiakirjaa. Juuri tämä riippumattomien COA-testien läpinäkyvyys muuttaa COA:ssa olevan pelkkän numeron luotettavaksi analyyttiseksi lausunnoksi.