Cálculo da diluição de péptidos

Para obter a concentração correta numa solução de péptido, é necessário dispor dos valores de entrada corretos, e não de estimativas. O princípio básico do cálculo da diluição é simples: a quantidade de péptido de que se dispõe efetivamente, a concentração que se pretende atingir e o volume final necessário. Se algum destes valores estiver errado, a quantidade em cada alíquota também estará errada, quer se trabalhe em mg/ml, µg por pipetagem ou mM.

Este guia centra-se nos cálculos laboratoriais para investigação. Aqui encontrará as fórmulas mais utilizadas, exemplos de cálculos claros e os erros mais comuns a evitar ao reconstituir e diluir peptides. Quer fazer os cálculos automaticamente? Experimente a nossa calculadora de péptidos.

Informações necessárias antes de começar a calcular

Antes de efetuar um cálculo de diluição, deve verificar os seguintes dados:

• Quantidade contida no « vial » – por exemplo, 5 mg ou 10 mg de péptido liofilizado
• Concentração pretendida – por exemplo, 2,5 mg/ml ou 1 mM
• Volume final pretendido – a quantidade total de soro ou solução de trabalho que pretende obter
• Dados do lote – sobretudo a pureza e, para cálculos molares, o peso molecular

Para cálculos em mg/ml, a massa e o volume são, muitas vezes, suficientes. Se precisar de fazer cálculos em mM ou µM, deve também utilizar o peso molecular do péptido. Para cálculos mais precisos, deve basear-se no Certificado de Análise (COA) do lote, em vez de se basear apenas na massa nominal indicada no rótulo. Pode também consultar a informação sobre o prazo de validade do peptides reconstituído ao planear o grau de diluição e a dimensão do lote.

Fórmulas utilizadas no cálculo da diluição de péptidos

Concentração em massa – mg/ml e µg por alíquota

A fórmula básica é C = m / V, em que C é a concentração, m é a massa e V é o volume. Se tiver 5 mg de péptido e adicionar 2 ml de solvente, a concentração passa a ser de 2,5 mg/ml. Se, em seguida, quiser saber qual é a quantidade presente em 100 µl, converta 100 µl em 0,1 ml e multiplique: 2,5 mg/ml × 0,1 ml = 0,25 mg, ou seja, 250 µg.

Se, pelo contrário, souber a concentração pretendida e quiser calcular a quantidade de líquido a adicionar, utilize a fórmula V = m / C. Exemplo: para que 10 mg de péptido atinjam uma concentração de 5 mg/ml, é necessário um volume total de 2 ml.

Concentração molar – mM e µM

Quando a concentração deve ser expressa em molaridade, é necessário conhecer o peso molecular do péptido. Uma fórmula prática é: mM = (mg/ml × 1000) / peso molecular. Se um péptido tiver um peso molecular de 2000 g/mol e a solução tiver uma concentração de 2 mg/ml, a concentração é de 1 mM. A mesma lógica aplica-se se quiser fazer o cálculo inverso e determinar qual o nível de mg/ml que corresponde a uma determinada concentração molar.

Fator de diluição entre a solução-mãe e a solução de trabalho

Quando já tiver uma solução-mãe, utilize a fórmula C1 x V1 = C2 x V2. Se a solução-mãe tiver uma concentração de 2,5 mg/ml e pretender preparar 1 ml de solução de trabalho a 0,25 mg/ml, então V1 = 0,1 ml. Isso significa 100 µl de solução-mãe e 900 µl de solvente. Esta fórmula é especialmente importante quando se pretende evitar pipetar volumes muito pequenos diretamente a partir do pó.

Exemplos de cálculos passo a passo

Na prática, o mais importante é escolher uma concentração da solução-mãe que permita obter volumes de pipetagem razoáveis. Uma solução que exija a retirada de apenas alguns microlitros é, muitas vezes, mais propensa a erros do que uma solução em que se possam utilizar pipetas de laboratório padrão dentro da sua gama de funcionamento mais precisa.

Tenha em conta a pureza, o certificado de análise (COA) e a quantidade real de péptido

A massa nominal nem sempre corresponde à quantidade real de péptido. Se um « vial » contiver 10 mg de material, mas a pureza do lote for de 95 por cento, isso corresponde a 9,5 mg de péptido. Se, em seguida, se preparar uma solução de 2 ml, obtém-se uma concentração nominal de 5 mg/ml, mas a concentração real de péptido passa a ser de 4,75 mg/ml.

Para comparações de rotina, a concentração nominal pode ser suficiente, mas, para estudos reprodutíveis, é preferível corrigir os dados relativos aos lotes. Isto é especialmente verdade quando pequenas diferenças na concentração afetam o resultado experimental. Se a forma salina, a humidade residual ou o teor de péptidos forem indicados na documentação, isso também pode afetar a verdadeira concentração molar.

No site 24Peptides, a transparência dos lotes é fundamental. Cada lote é testado por uma entidade independente e a documentação do Certificado de Análise (COA) permite verificar a pureza e a identidade antes de dissolver o « peptides » liofilizado e planear a diluição.

Erros comuns no cálculo da diluição de péptidos

• Confundir mg, µg, ml e µl
• Cálculo com base na massa nominal, sem verificar a pureza
• Esquecer o peso molecular quando o objetivo é mM ou µM
• Preparar a solução-mãe de forma a que o péptido se torne pouco solúvel
• Preparar a solução-mãe de forma tão diluída que cada alíquota exija volumes excessivamente grandes, o que torna a sua utilização impraticável
• Partindo do princípio de que o cálculo está correto, mesmo que o pó não se tenha dissolvido totalmente

Os cálculos podem estar corretos e, mesmo assim, conduzir a um resultado errado se a solução não for homogénea. Por isso, escolha um solvente adequado para o péptido em questão, por exemplo, água bacteriostática, adicione o líquido de forma controlada e misture suavemente até a solução ficar límpida e uniforme.

Orientações práticas para a reconstituição

O cálculo da diluição deve ser sempre acompanhado de boas práticas laboratoriais. Utilize instrumentos limpos, identifique sempre a solução indicando a concentração, a data, o lote e o solvente, e siga as especificações do produto, bem como as rotinas internas do laboratório. Se o péptido for sensível ou difícil de dissolver, a escolha do solvente é crucial para determinar se a concentração calculada é, de facto, útil na prática. Para obter orientações sobre a temperatura e o manuseamento após a reconstituição, consulte a secção «Armazenamento de peptides no laboratório».

Perguntas frequentes sobre o cálculo da diluição de péptidos

Como é que se calcula a quantidade de ml a adicionar a um « vial »?

Utilize a fórmula V = m / C. Se tiver 5 mg de péptido e pretender uma concentração de 2,5 mg/ml, o volume total deverá ser de 2 ml.

Como é que se calcula a quantidade de péptido por 100 µl?

Primeiro, converta 100 µl em 0,1 ml. Em seguida, multiplique a concentração em mg/ml por 0,1 ml. Uma solução a 2,5 mg/ml contém, portanto, 0,25 mg, ou seja, 250 µg, por cada 100 µl.

Quando devo ter em conta a pureza?

Corrija a pureza quando a quantidade real de péptido for importante para a conceção da experiência, a comparabilidade ou os cálculos molares. Nesse caso, utilize o certificado de análise (COA) do lote como base, em vez de se basear apenas na massa nominal indicada no rótulo.

Preciso de saber o peso molecular se trabalhar apenas em mg/ml?

Não. Para concentrações em massa puras, a massa e o volume são suficientes. O peso molecular só é necessário quando se fazem cálculos em mM, µM ou quando se comparam concentrações molares entre diferentes peptides.

Estas informações aplicam-se ao uso em seres humanos ou a injeções?

Não. Esta página diz respeito apenas a cálculos laboratoriais e ao manuseamento no âmbito da investigação. A 24Peptides comercializa materiais de investigação que não se destinam a uso humano. Os produtos destinam-se exclusivamente a fins de investigação, são reservados a maiores de 18 anos e devem ser manuseados em conformidade com os regulamentos da UE aplicáveis e as normas laboratoriais.